乳酸菌制劑對全株玉米青貯品質及營養成分的影響
導讀
青貯是指以新鮮青飼料為原料，在密閉條件下，利用植物表面自然附生的乳酸菌，通過厭氧發酵，將植物表面的可溶性碳水化合物轉化為乳酸、乙酸等有機酸，降低飼料pH，抑制霉菌等腐敗微生物生長繁殖，達到保持青飼料營養特性的目的。全株玉米青貯在反芻動物飼料供應中占有非常重要的地位，其由于具有營養價值高、適口性好和易保存等優點得到廣泛應用，對"節糧型"及"秸稈型"畜牧業生產的發展起到積極的推動作用。
但是，在很多地區由于青貯技術不過關，加之青貯原料表面附著的乳酸菌數量不足，不能有效縮短青貯過程中的有氧呼吸階段，造成腐敗微生物滋生，營養成分消耗嚴重，導致青貯品質下降和飼料資源浪費。如何生產高效、優質、安全的玉米青貯已成為行業內高度關注的問題。
近年來，關于提高青貯發酵品質添加劑的研究主要集中在微生物制劑、酶制劑、有機酸類、糖類等。綜合前人研究表明，以乳酸菌為主的微生物制劑因具有有效抑制腐敗微生物繁殖、降低青貯營養物質損失、提高青貯品質且效果較穩定等優勢而備受關注。乳酸菌根據其發酵產酸能力主要分為2類，一類是同型發酵乳酸菌，另一類是異型發酵乳酸菌。前者發酵葡萄糖產生乳酸，后者除產生乳酸外，還可產生乙酸、乙醇、二氧化碳等產物。
研究表明，同型發酵乳酸菌可有效提高發酵過程中青貯品質，而異型發酵乳酸菌在提高青貯有氧穩定性中具有重要作用。目前，關于利用乳酸菌制劑改善青貯飼料品質的研究多集中于單一菌種的添加，且研究表明2種類型的乳酸菌在提高青貯飼料品質方面均表現出各自的優勢，而利用同型和異型發酵乳酸菌協同作用于青貯飼料的研究還相對較少。
另外，由于受使用環境、添加劑量等方面的影響，導致部分已有研究結果仍存在差異，需進一步探討。因此，本研究以山東省2016年9月收獲的全株玉米為研究對象，采用同型和異型發酵乳酸菌復合制劑，探討不同劑量復合乳酸菌制劑對全株玉米青貯品質及營養成分的影響，以期為乳酸菌制劑的推廣應用提供參考依據。
1材料與方法
1.1 試驗材料
試驗材料為山東省2016年9月刈割新鮮全株玉米，營養成分含量[干物質(DM)基礎]：有機物(OM)86.84％ ，粗蛋白質(CP)8.27％ ，中性洗滌纖維(NDF)55.95％，酸性洗滌纖維(ADF)26.03％。青貯袋(75cm x 40cm x 8cm)分內外2層，外層為聚丙烯材料，內層為聚乙烯材料。乳酸菌制劑(11GFT，加拿大Pioneer Hi-Bred公司)，每克產品含有1.1×1011CFU乳酸菌，包括布氏乳桿菌和干酪乳桿菌2種。
1.2 試驗設計
選取籽粒處于蠟熟期的新鮮全株玉米720 kg，品種為登海605，外觀呈綠色，含水量為73.67％，切短至1～4 cm，平均分為4組，每組12個重復，每個重復15 kg。對照組每個重復噴霧添加45 mL去離子水，試驗組分別噴霧添加2、10和20 mg/kg的乳酸菌制劑(預先稀釋于45 mL去離子水中)，分別混合均勻。然后將全株玉米青貯快速裝填并壓實于青貯袋中，置于室溫條件下密封保存，試驗期60 d。
1.3 樣品采集及指標測定
于第45和60天分別開袋取樣，每組取樣6個重復，進行相關指標的測定。
1.3.1 感官評價指標
按照德國農業協會(DLG)青貯質量感官評分標準進行評定，根據青貯的氣味(14分)、結構(4分)、色澤(2分)進行評分。綜合3項得分，評定為優(16～20分)、可(10～15分)、中(5～9分)、下(0~4分)4個等級。
1.3.2 微生物數量
取新鮮樣本30 g，加入到盛有270 mL生理鹽水的塑料袋或樣品瓶中，充分攪拌后將此溶液稀釋10～107倍數。微生物數量測定采用平板計數法，乳酸菌用MRS瓊脂培養基進行計數，稱取64.25 g MRS培養基于1L蒸餾水中，加熱煮沸溶解后置于121℃高壓滅菌15 min，傾注平板備用。取100μL不同濃度的接種液分別接種于平板上，涂勻后置于厭氧培養箱中37℃培養2 d，分別對平板上的乳酸菌進行計數。霉菌采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基進行計數，稱取40.1 g馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基于1 L蒸餾水中，加熱煮沸溶解后置于121 ℃高壓滅菌20 min，傾注平板后備用。取100 μL不同濃度的接種液分別接種于平板上，涂勻后置于37℃恒溫培養箱中培養2～4 d分別進行計數(每個平板上菌落數控制在30～300個之間為有效)。
1.3.3 pH測定
取10 g新鮮樣本，加入90 mL去離子水，4℃浸提24 h，采用pH計(HI9025，意大利Hanna In-struments公司)測定濾液pH。
1.3.4 有機酸及氨態氮含量測定
取35 g新鮮樣本，放入100 mL的廣口三角瓶中，加人70 mL去離子水，4℃浸提24 h，然后通過2層紗布和定性濾紙過濾，所得的液體為青貯浸提液，置于-20℃條件下保存待測。濾液用來測定乳酸(LA)、揮發性脂肪酸(VFA)和氨態氮(NH3 -N)含量。乳酸含量采用對羥基聯苯法測定 ，以乳酸鈣為標準品做標準曲線，計算乳酸含量，結果以g/kg DM 計。揮發性脂肪酸(VFA)含量采用高效氣相色譜儀(GC-2010，日本島津公司)進行測定 ，包括乙酸、丙酸和丁酸含量，結果以g/kg DM計。氨態氮含量采用苯酚一次氯酸鈉比色法進行測定，以氯化銨為標準品做標準曲線，計算氨態氮含量，結果以g/kg TN(總氮)計。
1.3.5 化學成分測定
取新鮮全株玉米青貯制備風干樣本，按照AOAC(2015)中的方法測定OM、CP、NDF及ADF含量。水溶性碳水化合物(water.soluble carbohydrate，WSC)含量采用蒽酮硫酸比色法測定 ，以葡萄糖為標準品做標準曲線，計算WSC含量，結果以g/kg DM計。
1.4 數據統計與分析
數據經Excel 2007初步整理后，采用SPSS16.0軟件中的單因素方差分析(one-way ANOVA)進行統計分析，多重比較采用Duncan氏多重比較檢驗，結果以平均值(mean)和均方根誤差(SEM)表示，P<0.05為差異顯著。
2結 果
2.1 乳酸菌制劑對全株玉米青貯感官評價指標的影響
由表1可見，各組全株玉米青貯氣味、結構、色澤及綜合評分均無顯著差異(P>0.05)。
2.2 乳酸菌制劑對全株玉米青貯微生物數量的影響
由表2可見，與對照組相比，2、10和20 mg/kg組45 d的乳酸菌數量分別提高了24.54％ 、25.96％和25.11％，差異均顯著(P<0.05)，霉菌數量分別降低了10.09％(P>0.05)、20.00％(P<0.05)和14.13％(P>0.05)；2、10和20 mg/kg組60 d的乳酸菌數量分別提高17.44％ 、20.93％和20.54％ ，差異均顯著(P<0.05)，霉菌數量分別降低31.01％、29.65％和28.29％ ，差異均顯著(P<0.05)。
2.3 乳酸菌制劑對全株玉米青貯pH及有機酸含量的影響
由表3可見，45和60 d，各組的pH均無顯著差異(P>0.05)。45 d，2、10和20 mg/kg組的乳酸含量較對照組分別提高10.63％ 、7.90％和8.05％ ，差異均顯著(P<0.05)，乙酸含量分別提高了364.10％、288.76％和285.40％，差異均顯著(P<0.05)，而丁酸含量分別降低17.72％、15.19％和11.39％，差異均顯著(P<0.05)。60 d，與對照組相比，2及10 mg/kg組乙酸含量分別提高767.17％和171.73％，差異顯著(P<0.05)，各組其他指標無顯著差異(P>0.05)。
2.4 乳酸菌制劑對全株玉米青貯化學成分的影響
由表4可見，45 d，與對照組相比，2和20 mg/kg組CP含量提高了7.70％和11.85％ ，差異顯著(P<0.05)，2 mg/kg組NDF含量提高了15.90％，差異顯著(P<0.05)，2、10和20 mg/kg組氨態氮含量分別顯著降低了15.44％、21.87％和18.60％(P<0.05)。60 d，20 mg/kg組WSC含量較對照組降低了33.14％ ，差異顯著(P<0.05)，其他指標間無顯著差異(P>0.05)。
討 論
3.1 乳酸茵制劑對全株玉米青貯品質的影響
青貯的基本原理是利用好氣性微生物和植物細胞本身的呼吸作用使青貯窖內盡快形成厭氧環境，然后在密閉厭氧條件下利用乳酸菌的活動，產生乳酸，抑制其他腐敗微生物的活動，達到飼料長期保存及使用的目的，一般包括好氧細菌活動階段，乳酸菌發酵階段和發酵穩定階段等。本研究表明，各組全株玉米青貯感官評價綜合評分均在16～20分，達到優級標準，說明各組青貯效果均較好。微生物數量方面，添加乳酸菌制劑組的乳酸菌數量顯著提高，霉菌數量均有不同程度降低，這與前人研究結果類似 ，說明添加乳酸菌制劑可以促使乳酸菌成為青貯過程中的優勢菌群，縮短好氧細菌活動階段，對霉菌等有害微生物產生抑制作用。有機酸含量分析結果表明，添加乳酸菌制劑可提高發酵45 d乳酸含量，表明添加乳酸菌制劑可以提高青貯早期乳酸生成量，改善青貯品質。但各組發酵60 d乳酸含量無顯著差異，且60 d乳酸含量較45 d降低。分析原因為本試驗采用的乳酸菌制劑為布氏乳桿菌和干酪乳桿菌混合劑，其中布氏乳桿菌屬異型發酵乳酸菌，能分解乳酸產生揮發性脂肪酸如乙酸等。Kung等將3種劑量(1x105 、5x105、1x106 CFU/g)布氏乳桿菌接種于紫花苜蓿中發酵56 d，結果表明乳酸含量不同程度降低，乙酸含量升高。呂文龍等 將布氏乳桿菌接種于青玉米秸進行發酵，發現低劑量布氏乳桿菌可以一定程度上提高乳酸生成量，但隨著儲存時間的延長及劑量的提高，乳酸含量顯著降低，乙酸含量顯著升高。干酪乳桿菌屬乳桿菌屬，兼性異型發酵乳糖。Nishino等報道，將干酪乳桿菌接種于全株玉米(2x106 CFU/g)和全混合日糧(3×106 CFU/g)發酵60 d后，乳酸含量提高，乙酸含量顯著降低。隨后，Nishino等在羊茅草、全株玉米及全混合 日糧中分別接種干酪乳桿菌，發酵60 d，結果也發現乳酸含量提高，乙酸含量降低。表明干酪乳桿菌可以提高青貯乳酸生成量、降低乙酸生成量。因此，本研究觀測到的45 d試驗組乳酸含量的升高可能與干酪乳桿菌的早期定植并發酵產生乳酸有關。但隨著發酵時間的延長，布氏乳桿菌可在后期大量繁殖 ，可能利用了干酪乳桿菌發酵產生的乳酸，導致60 d乳酸含量較45 d降低。另外，本研究還發現試驗組乙酸含量較對照組有不同程度提高，且隨著發酵時間的延長，乙酸含量繼續升高。據報道，布氏乳桿菌在發酵過程中能將乳酸分解成乙酸和丙二醇，而相對乳酸而言，乙酸等揮發性脂肪酸是一種更有效的抗真菌及霉菌的酸類物質，因此更有利于提高青貯的有氧穩定性。綜上，本研究發現的乳酸、乙酸含量的變化可能是布氏乳桿菌和干酪乳桿菌共同作用的結果。丁酸是由腐敗菌和酪酸菌分別分解蛋白質、葡萄糖和乳酸而生成的產物，其含量的高低反映青貯飼料品質的優劣，丁酸含量越多，青貯品質越差。本研究發現添加乳酸菌制劑可以降低45 d青貯的丁酸含量，這與霉菌等腐敗菌數量的降低相符合。
3.2 乳酸菌制劑對全株玉米青貯營養成分的影響
全株玉米青貯的營養成分是評價青貯質量好壞的另一項重要指標。本研究發現，添加乳酸菌制劑可以一定程度上提高全株玉米青貯的CP含量，降低其中氨態氮的比例。青貯飼料中氨態氮主要由植物酶對蛋白質的降解和微生物分解利用蛋白質和氨基酸產生，總氮中氨態氮含量反映了青貯飼料蛋白質降解的程度 。Nishino等將布氏乳桿菌、干酪乳桿菌分別接種于羊茅草和全混合日糧中進行發酵，結果表明氨態氮含量均顯著降低。Li等 報道，在玉米秸稈中接種復合乳酸菌制劑發酵150 d后，總氮中氨態氮含量較對照組顯著降低，CP含量顯著提高。上述試驗結果均與本研究類似，推測乳酸菌可能通過降低全株玉米在儲存過程中蛋白質的降解作用或抑制腐敗微生物的分解作用，從而降低總氮中氨態氮含量，間接提高CP含量，提高了其營養價值。此外，研究還發現試驗組NDF含量不同程度升高，WSC含量降低，這與Addah等的研究結果類似。玉米秸稈中含有較為豐富的WSC，為乳酸菌的定植提供了豐富的營養物質，因此乳酸菌的加入可能利用了秸稈中的WSC，使得細胞壁中難以降解的碳水化合物如NDF等組分有所升高。
綜合各營養成分指標結果發現，盡管試驗組CP含量較對照組提高，但各組OM含量差異并不顯著，說明試驗組全株玉米青貯的無氮化合物含量存在一定程度降低，這可能與乳酸菌利用了全株玉米青貯的可溶性碳水化合物等營養成分進行生長繁殖有關，乳酸菌的生長抑制了因腐敗微生物作用引起的蛋白質的降解，從而使青貯品質維持在較高水平。這也與本研究觀測到的發酵60 d全株玉米青貯的OM和WSC含量較45 d降低，而CP含量基本不變的結果相吻合。
4結 論
在本試驗條件下，添加乳酸菌制劑可以改善全株玉米青貯品質，提高營養價值。以青貯發酵過程中霉菌數量最低為依據，推薦乳酸菌制劑的添加量為10 mg/kg。
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