混合菌種兩步發(fā)酵法對(duì)豆粕肽轉(zhuǎn)化及品質(zhì)的影響
豆粕，又稱“大豆粕”是大豆提取豆油后所得的一種副產(chǎn)品，它的營(yíng)養(yǎng)成分主要有蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物，以及多種礦物質(zhì)、纖維素和必需氨基酸，是一種營(yíng)養(yǎng)豐富、營(yíng)養(yǎng)成分種類齊全、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量均衡的植物性蛋白飼料源。但是豆粕所含蛋白質(zhì)中的水溶性蛋白質(zhì)占據(jù)很大比重，由于這些水溶性蛋白質(zhì)分子量較大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，如果直接將豆粕用于飼養(yǎng)動(dòng)物，豆粕中的蛋白質(zhì)被消化吸收利用率不高，就會(huì)造成豆粕資源浪費(fèi)，從而提高了飼養(yǎng)成本，限制了豆粕的廣泛應(yīng)用。因此，降解豆粕蛋白才能進(jìn)一步提高豆粕的營(yíng)養(yǎng)性能和使用價(jià)值，擴(kuò)大豆粕的使用范圍。
作為降解蛋白質(zhì)效果來看，對(duì)豆柏進(jìn)行微生物發(fā)酵處理是最理想的方法。微生物發(fā)酵的原理是利用微生物在發(fā)酵過程中可產(chǎn)生呼吸酶、發(fā)酵酶和水解酶，可以分解豆粕蛋白產(chǎn)生小肽。因此，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)發(fā)酵豆柏開展了大量研究。楊柳等采用枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、植物乳桿菌混合固態(tài)發(fā)酵豆粕，可獲得可溶性蛋白質(zhì)的含量為165.8μmol/g，大豆球蛋白的含量為11.4μmol/g。張良等采用米曲霉、枯草芽孢桿菌、根霉和酵母菌，進(jìn)行混合菌固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)大豆肽的含量達(dá)17.97%。吳寶昌等對(duì)枯草芽飽桿菌與黑曲霉混合發(fā)酵制備豆粕飼料的條件進(jìn)行研究，在最優(yōu)條件下測(cè)得發(fā)酵豆粕的肽轉(zhuǎn)化率值為40.8%。Laura等用12株對(duì)乳酸菌發(fā)酵豆粕研究發(fā)現(xiàn)，大部分乳酸菌可降解大豆蛋白并提高了游離氨基酸、主要必需氨基酸和風(fēng)味氨基酸前體含量。
本試驗(yàn)以大豆肽的轉(zhuǎn)化率為試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，利用枯草芽孢桿菌、黑曲霉、釀酒酵母和保加利亞乳酸桿菌，進(jìn)行混合菌固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)大豆肽，利用種間互惠、偏利共生等關(guān)系，進(jìn)行協(xié)同發(fā)酵。該方法成本低，是代替酶解蛋白和酸解蛋白較好的方法。
1材料與方法
1.1 材料
豆粕：益海嘉里（安徽）糧油工業(yè)有限公司購(gòu)買（水分為7.66 %、粗蛋白為40.60 %、脂肪為3.51 %、灰分為5.89 %及碳水化合物為42.34 %）。
菌種：枯草芽孢桿菌、黑曲霉、啤酒酵母和保加利亞乳酸桿菌均由來自安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保藏。
LB培養(yǎng)液：牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、pH7.0～7.2，經(jīng)121 ℃蒸汽滅菌30 min 備用。
察氏培養(yǎng)液：杭州百思生物技術(shù)有限公司提供。MRS培養(yǎng)液：杭州百思生物技術(shù)有限公司提供。
1.2 主要設(shè)備
凱氏定氮儀： 濟(jì)南海能儀器有限公司；GZX-9146MBE 數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備；DL-5-B飛鴿牌離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；SWCJ-1D 超凈工作臺(tái)： 江蘇通凈設(shè)備公司；PHSJ-4A PH計(jì)：合肥原點(diǎn)生物科技有限公司；ML204/02 電子天平：梅特勒托利多儀器（上海）有限公司；SHA-C 水浴恒溫震蕩器：金壇市杰瑞爾電器有限公司；UV-180 型紫外分光光度機(jī)：上海美譜達(dá)儀器公司；DHP-9162 型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；LDZX-30KBS 立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；KNT-IV-10超純水機(jī)：北京塞多利斯科儀器廠；DFT-100 多功能中藥粉粹機(jī)：溫嶺市大德中藥機(jī)械有限公司。
1.3 方法
1.3.1 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定方法
取裝有培養(yǎng)液的250 mL 錐形瓶，貼上標(biāo)簽（注明菌名、培養(yǎng)處理）。按無菌操作法用接種環(huán)挑取單菌落加入于培養(yǎng)液中。將接種后的培養(yǎng)基置于振蕩培養(yǎng)箱中，在適應(yīng)的溫度條件下培養(yǎng)，分別光電比濁測(cè)定4種菌種的生長(zhǎng)曲線，確定其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。
1.3.2 豆粕第一步發(fā)酵單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)的方法
本試驗(yàn)主要確定混合菌種（枯草芽孢桿菌和黑曲霉）第一步發(fā)酵法最優(yōu)方法，考察發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、接種量、培養(yǎng)基含水量和菌種體積比例對(duì)大豆肽轉(zhuǎn)化率的影響。
1.3.2.1 第一步單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)
1）發(fā)酵時(shí)間對(duì)大豆肽轉(zhuǎn)化率影響
總接種量為8 %，菌種體積比例為1 ∶ 1，發(fā)酵溫度為34 ℃，發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量為55 %設(shè)為初始條件，發(fā)酵時(shí)間分別設(shè)定為48、60、72、84、96 h， 考察發(fā)酵時(shí)間對(duì)大豆肽轉(zhuǎn)化率影響。
2）發(fā)酵溫度對(duì)大豆肽轉(zhuǎn)化率影響
總接種量為8 %，菌種體積比例為1 ∶ 1，發(fā)酵時(shí)間為72 h， 發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量為55 %設(shè)為初始條件，發(fā)酵溫度分別設(shè)定為30、32、34、36、38 ℃，考察發(fā)酵溫度對(duì)大豆肽轉(zhuǎn)化率影響。
3）發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量對(duì)大豆肽的轉(zhuǎn)化率影響
總接種量為8 %， 菌種體積比例為1 ∶ 1， 發(fā)酵時(shí)間為72 h，發(fā)酵溫度為34 ℃，設(shè)為初始條件，發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量分別設(shè)定為45 %、50 %、55 %、60 %、65 %，考察發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量對(duì)大豆肽轉(zhuǎn)化率影響。
4）總接種量對(duì)大豆肽轉(zhuǎn)化率影響
菌種體積比例為1 ∶ 1，發(fā)酵時(shí)間為72 h，發(fā)酵溫度為34 ℃，發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量為55 %設(shè)為初始條件，總接種量分別設(shè)定為4 %、6 %、8 %、10 %、12 %，考察總接種量對(duì)大豆肽轉(zhuǎn)化率影響。
5）菌種體積比例對(duì)大豆肽轉(zhuǎn)化率影響
總接種量為8 %， 發(fā)酵時(shí)間為72 h， 發(fā)酵溫度為34 ℃， 發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量為55 %設(shè)為初始條件，菌種體積比例（枯草芽孢桿菌∶黑曲霉）分別設(shè)定為1 ∶ 3、1 ∶ 2、1 ∶ 1、2 ∶ 1、3 ∶ 1，考察菌種體積比例對(duì)大豆肽轉(zhuǎn)化率影響。
1.3.2.2 第一步發(fā)酵正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)
根據(jù)第一步發(fā)酵單因素試驗(yàn)得到的結(jié)果和Box-Behnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理， 通過Design Expert軟件對(duì)本試驗(yàn)展開設(shè)計(jì)以及數(shù)據(jù)分析處理，并檢驗(yàn)其有效性。
1.3.3 豆粕第二步發(fā)酵單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)的方法
本試驗(yàn)主要確定混合菌種（保加利亞乳酸桿菌和啤酒酵母）第二步發(fā)酵法最優(yōu)方法，考察發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、接種量、培養(yǎng)基含水量和菌種體積比例對(duì)大豆肽轉(zhuǎn)化率的影響。
1.3.3.1 第二步發(fā)酵單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)
1）發(fā)酵時(shí)間對(duì)大豆肽轉(zhuǎn)化率影響
總接種量為6 %，菌種體積比例為1 ∶ 1，發(fā)酵溫度為34 ℃，發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量為40 %設(shè)為初始條件，發(fā)酵時(shí)間分別設(shè)定為24、36、48、60、72 h， 考察發(fā)酵時(shí)間對(duì)大豆肽轉(zhuǎn)化率影響。
2）發(fā)酵溫度對(duì)大豆肽轉(zhuǎn)化率影響
總接種量為6 %，菌種體積比例為1 ∶ 1，發(fā)酵時(shí)間為48 h， 發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量為40 %設(shè)為初始條件，發(fā)酵溫度分別設(shè)定為30、32、34、36、38 ℃，考察發(fā)酵溫度對(duì)大豆肽轉(zhuǎn)化率影響。
3）發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量對(duì)大豆肽轉(zhuǎn)化率影響
總接種量為6 %，菌種體積比例為1 ∶ 1，發(fā)酵時(shí)間為48 h，發(fā)酵溫度為34 ℃設(shè)為初始條件，發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量分別設(shè)定為30 %、35 %、40 %、45 %、50 %，考察發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量對(duì)大豆肽轉(zhuǎn)化率影響。
4）總接種量對(duì)大豆肽轉(zhuǎn)化率影響
菌種體積比例為1 ∶ 1，發(fā)酵時(shí)間為48 h，發(fā)酵溫度為34 ℃，發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量為40 %設(shè)為初始條件，總接種量分別設(shè)定為2 %、4 %、6 %、8 %、10 %， 考察總接種量對(duì)大豆肽轉(zhuǎn)化率影響。
5）菌種體積比例對(duì)大豆肽轉(zhuǎn)化率影響
總接種量為6 %， 發(fā)酵時(shí)間為48 h， 發(fā)酵溫度為34 ℃，發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量為40 %，設(shè)為初始條件，菌種體積比例（保加利亞乳酸桿菌∶ 釀酒酵母）分別設(shè)定為1 ∶ 3、1 ∶ 2、1 ∶ 1、2 ∶ 1、3 ∶ 1， 考察菌種體積比例對(duì)大豆肽轉(zhuǎn)化率影響。
1.3.3.2 第二步發(fā)酵正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)
根據(jù)第二步發(fā)酵單因素試驗(yàn)得到的結(jié)果和Box-Behnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理， 通過Design Expert軟件對(duì)本試驗(yàn)展開設(shè)計(jì)以及數(shù)據(jù)分析處理，并檢驗(yàn)其有效性。
1.3.3 豆粕第二步發(fā)酵單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)的方法
本試驗(yàn)主要確定混合菌種（保加利亞乳酸桿菌和啤酒酵母）第二步發(fā)酵法最優(yōu)方法，考察發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、接種量、培養(yǎng)基含水量和菌種體積比例對(duì)大豆肽轉(zhuǎn)化率的影響。
1.3.3.1 第二步發(fā)酵單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)
1）發(fā)酵時(shí)間對(duì)大豆肽轉(zhuǎn)化率影響
總接種量為6 %，菌種體積比例為1 ∶ 1，發(fā)酵溫度為34 ℃，發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量為40 %設(shè)為初始條件，發(fā)酵時(shí)間分別設(shè)定為24、36、48、60、72 h， 考察發(fā)酵時(shí)間對(duì)大豆肽轉(zhuǎn)化率影響。
2）發(fā)酵溫度對(duì)大豆肽轉(zhuǎn)化率影響
總接種量為6 %，菌種體積比例為1 ∶ 1，發(fā)酵時(shí)間為48 h， 發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量為40 %設(shè)為初始條件，發(fā)酵溫度分別設(shè)定為30、32、34、36、38 ℃，考察發(fā)酵溫度對(duì)大豆肽轉(zhuǎn)化率影響。
3）發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量對(duì)大豆肽轉(zhuǎn)化率影響
總接種量為6 %，菌種體積比例為1 ∶ 1，發(fā)酵時(shí)間為48 h，發(fā)酵溫度為34 ℃設(shè)為初始條件，發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量分別設(shè)定為30 %、35 %、40 %、45 %、50 %，考察發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量對(duì)大豆肽轉(zhuǎn)化率影響。
4）總接種量對(duì)大豆肽轉(zhuǎn)化率影響
菌種體積比例為1 ∶ 1，發(fā)酵時(shí)間為48 h，發(fā)酵溫度為34 ℃，發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量為40 %設(shè)為初始條件，總接種量分別設(shè)定為2 %、4 %、6 %、8 %、10 %， 考察總接種量對(duì)大豆肽轉(zhuǎn)化率影響。
5）菌種體積比例對(duì)大豆肽轉(zhuǎn)化率影響
總接種量為6 %， 發(fā)酵時(shí)間為48 h， 發(fā)酵溫度為34 ℃，發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量為40 %，設(shè)為初始條件，菌種體積比例（保加利亞乳酸桿菌∶ 釀酒酵母）分別設(shè)定為1 ∶ 3、1 ∶ 2、1 ∶ 1、2 ∶ 1、3 ∶ 1， 考察菌種體積比例對(duì)大豆肽轉(zhuǎn)化率影響。
1.3.3.2 第二步發(fā)酵正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)
根據(jù)第二步發(fā)酵單因素試驗(yàn)得到的結(jié)果和Box-Behnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理， 通過Design Expert軟件對(duì)本試驗(yàn)展開設(shè)計(jì)以及數(shù)據(jù)分析處理，并檢驗(yàn)其有效性。
1.4 蛋白質(zhì)及肽的轉(zhuǎn)化率測(cè)定方法
1.4.1 蛋白質(zhì)測(cè)定方法
采用凱氏定氮測(cè)定。
1.4.2 肽的轉(zhuǎn)化率測(cè)定方法
大豆肽轉(zhuǎn)化率/%=酸溶蛋白含量/原豆粕蛋白含量×100酸溶蛋白含量：采用三氯乙酸法測(cè)定。
2結(jié)果與分析
2.1 種子擴(kuò)培時(shí)間的確定
種子擴(kuò)大培養(yǎng)是發(fā)酵工程一個(gè)重要的組成部分，本試驗(yàn)將冷凍干燥管中處休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入液體培養(yǎng)基中，通過培養(yǎng)一段時(shí)間后獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌種。4種菌種的生長(zhǎng)曲線見圖1。
通過圖1 可以得出4 種菌種種子擴(kuò)培時(shí)間，4 條曲線分別為枯草芽孢桿菌20 h，黑曲霉32 h，釀酒酵母菌18 h，保加利亞乳酸桿菌18 h。
2.2 第一步發(fā)酵單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)結(jié)果
2.2.1 第一步發(fā)酵單因素試驗(yàn)結(jié)果
圖2為第一步發(fā)酵時(shí)間對(duì)大豆肽轉(zhuǎn)化率的影響。
由圖2能夠看出，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間從48 h延長(zhǎng)至72 h，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，微生物大量繁殖，分解豆粕中的蛋白質(zhì)的速度加快，使大豆肽含量增加，是由于混菌之間為協(xié)同關(guān)系共同產(chǎn)生蛋白酶水解大豆蛋白，這是前72 h大豆肽轉(zhuǎn)化率快速上升的主要原因。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間超過72 h 時(shí)，大豆肽轉(zhuǎn)化率基本保持不變。
圖3為第一步發(fā)酵溫度對(duì)大豆肽轉(zhuǎn)化率的影響。
由圖3 能夠看出，當(dāng)溫度從30 ℃升高到36 ℃時(shí)，大豆肽的轉(zhuǎn)化率也在平緩增加。這是由于溫度上升，導(dǎo)致枯草芽孢桿菌和黑曲霉的生長(zhǎng)繁衍加快，而且隨溫度升高枯草芽孢桿菌和黑曲霉產(chǎn)生的蛋白酶能夠加快分解大豆蛋白速度。當(dāng)溫度超過36 ℃時(shí)，大豆肽的產(chǎn)量有下降的趨勢(shì)，是因?yàn)槠叩臏囟纫种瓶莶菅挎邨U菌和黑曲霉正常的生長(zhǎng)代謝，同時(shí)損壞枯草芽孢桿菌和黑曲霉產(chǎn)生的分解大豆蛋白的蛋白酶功能，最后使得大豆肽的轉(zhuǎn)化率值略微下降。
圖4為第一步發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量對(duì)大豆肽轉(zhuǎn)化率的影響。
由圖4 能夠看出，發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量從45 %上升到60 %過程中，大豆肽轉(zhuǎn)化率也呈現(xiàn)出逐步上升現(xiàn)象。這是因?yàn)樗质蔷S持枯草芽孢桿菌和黑曲霉正常的生理活動(dòng)的必要生命營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)也是能提高枯草芽孢桿菌和黑曲霉產(chǎn)生分解豆粕蛋白的蛋白酶活力。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量超過60 %，大豆肽轉(zhuǎn)化率急劇下降。這是因?yàn)檫^多的水分可能影響枯草芽孢桿菌和黑曲霉細(xì)胞膜的通透性，從而影響枯草芽孢桿菌和黑曲霉生產(chǎn)蛋白酶功能，所以導(dǎo)致大豆肽轉(zhuǎn)化率下降。
圖5 為第一步發(fā)酵總接種量對(duì)大豆肽轉(zhuǎn)化率的影響。
由圖5 能夠看出，總接種量從4 %到8 %時(shí)，大豆肽轉(zhuǎn)化率是按照一定的比例增長(zhǎng)。這是因?yàn)榧哟罂莶菅挎邨U菌和黑曲霉接種量，使得枯草芽孢桿菌和黑曲霉生產(chǎn)分解大豆蛋白的蛋白酶的量增多。當(dāng)總接種量超過8 %時(shí)，大豆肽轉(zhuǎn)化率下降。這是因?yàn)榻臃N枯草芽孢桿菌和黑曲霉量過大，致使枯草芽孢桿菌和黑曲霉生長(zhǎng)速度過快，從而消耗大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而導(dǎo)致大豆肽含量下降。
圖6 為第一步發(fā)酵菌種體積比例對(duì)大豆肽轉(zhuǎn)化率的影響。
由圖6能夠看出， 隨著枯草芽孢桿菌占總接種量的比例逐漸增大，大豆肽轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)升高趨勢(shì)。這種現(xiàn)象可能的原因是枯草芽孢桿菌比黑曲霉生產(chǎn)分解大豆蛋白的蛋白酶的量多，或者枯草芽孢桿菌比黑曲霉生產(chǎn)蛋白酶分解大豆蛋白的能力更強(qiáng)。因此，發(fā)酵菌種體積比例為2 ∶ 1時(shí)大豆肽轉(zhuǎn)化率最高。
2.2.2 第一步發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果分析
通過正交試驗(yàn)， 以大豆肽的轉(zhuǎn)化率為參考指標(biāo)，來研究這四因素三水平對(duì)大豆肽的轉(zhuǎn)化率的影響程度，見表3、表4。
通過表3、表4能夠得出，最適水平組合為A1B2C3D3，即發(fā)酵溫度為34 ℃，培養(yǎng)基的含水量為60 %，總接種量為10 %，菌種體積比例為3 ∶ 1。分別對(duì)大豆肽轉(zhuǎn)化率影響的4 個(gè)因素順序?yàn)椋築（發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量）>C（總接種量）>D（菌種比例）>A（發(fā)酵溫度）。由方差分析表顯示：發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量、總接種量和菌種比例3個(gè)因素都具有顯著性。2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)對(duì)最優(yōu)組合A1B2C3D3驗(yàn)證試驗(yàn)，作3 個(gè)平行，結(jié)果取平均值，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果為52.01 %，同試驗(yàn)理論結(jié)果接近。
2.3 第二步發(fā)酵單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)結(jié)果
2.3.1 第二步發(fā)酵單因素試驗(yàn)結(jié)果
圖7為第二步發(fā)酵時(shí)間對(duì)大豆肽轉(zhuǎn)化率的影響。
由圖7能夠看出，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間從24 h延長(zhǎng)至48 h，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，微生物大量繁殖，分解豆粕中的蛋白質(zhì)的速度加快，使大豆肽含量增加，是由于混菌之間為協(xié)同關(guān)系共同產(chǎn)生蛋白酶水解大豆蛋白，這是前48 h大豆肽轉(zhuǎn)化率快速上升的主要原因。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間超過48 h 時(shí)，大豆肽略有下降。可能原因是發(fā)酵后期釀酒酵母和保加利亞乳酸桿菌發(fā)生自溶現(xiàn)象，另一原因是隨著發(fā)酵時(shí)間的延伸，豆粕中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足以使釀酒酵母和保加利亞乳酸桿菌開始變?yōu)楦?jìng)爭(zhēng)關(guān)系而相互抑制。
圖8 為第二步發(fā)酵溫度對(duì)大豆肽轉(zhuǎn)化率的影響。
由圖8 能夠看出，當(dāng)溫度從30 ℃升高到36 ℃時(shí)，大豆肽轉(zhuǎn)化率也在逐漸增加。這是由于溫度上升，導(dǎo)致釀酒酵母和保加利亞乳酸桿菌的生長(zhǎng)繁衍加快，而且隨溫度升高釀酒酵母和保加利亞乳酸桿菌的蛋白酶能加快分解大豆蛋白速度。當(dāng)溫度超過36 ℃時(shí)，大豆肽含量急速下降，是因?yàn)檫^高的溫度抑制釀酒酵母和保加利亞乳酸桿菌生長(zhǎng)代謝，同時(shí)損壞釀酒酵母和保加利亞乳酸桿菌產(chǎn)生的分解大豆蛋白的蛋白酶功能，最后使得大豆肽轉(zhuǎn)化率值變小。
圖9為第二步發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量對(duì)大豆肽轉(zhuǎn)化率的影響。
由圖9能夠看出， 發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量從30 %上升到45 %過程中，大豆肽轉(zhuǎn)化率也呈現(xiàn)出逐步上升現(xiàn)象。這是因?yàn)樗质蔷S持釀酒酵母和保加利亞乳酸桿菌正常的生理活動(dòng)的必要生命營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)也是能提高釀酒酵母和保加利亞乳酸桿菌產(chǎn)生分解豆粕蛋白的蛋白酶活力。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量超過45 %，大豆肽轉(zhuǎn)化率急劇下降。這是因?yàn)檫^多的水分可能影響釀酒酵母和保加利亞乳酸桿菌細(xì)胞膜的通透性，會(huì)進(jìn)一步影響釀酒酵母和保加利亞乳酸桿菌生產(chǎn)蛋白酶功能，所以大豆肽轉(zhuǎn)化率下降。
圖10 為第二步發(fā)酵總接種量對(duì)大豆肽轉(zhuǎn)化率的影響。
由圖10 能夠看出， 總接種量從2 %到8 %時(shí)，大豆肽的轉(zhuǎn)化率是按照一定的比例增長(zhǎng)。這是因?yàn)榧哟筢劸平湍负捅＜永麃喨樗釛U菌接種量，使得釀酒酵母和保加利亞乳酸桿菌生產(chǎn)分解大豆蛋白的蛋白酶的量增多。當(dāng)總接種量超8 %時(shí)，大豆肽轉(zhuǎn)化率呈下降趨勢(shì)。這是因?yàn)榻臃N釀酒酵母和保加利亞乳酸桿菌量過大， 致使釀酒酵母和保加利亞乳酸桿菌生長(zhǎng)速度過快，從而消耗大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而導(dǎo)致大豆肽轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。
圖11 為第二步發(fā)酵菌種體積比例對(duì)大豆肽轉(zhuǎn)化率的影響。
由圖11 能夠看出，隨著保加利亞乳酸桿菌占總接種量的比例逐漸增大,大豆肽轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)升高趨勢(shì),當(dāng)菌種體積比為2 ∶ 1時(shí)肽轉(zhuǎn)化率最高, 此時(shí)大豆肽轉(zhuǎn)化率最大值為63.43 %。這種現(xiàn)象可能的原因是保加利亞乳酸桿菌比釀酒酵母生產(chǎn)分解大豆蛋白的蛋白酶的量多，或者保加利亞乳酸桿菌比釀酒酵母生產(chǎn)蛋白酶分解大豆蛋白的能力更強(qiáng)。
2.3.2 第二步發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果
通過正交試驗(yàn)， 以大豆肽的轉(zhuǎn)化率為參考指標(biāo)，來研究這四因素對(duì)大豆肽的轉(zhuǎn)化率的影響程度，見表5、表6。
通過表5、表6 能夠得出， 最適水平組合為A2B2C1D2，即菌種體積比例為2 ∶ 1、發(fā)酵溫度為36 ℃，培養(yǎng)基的含水量為40 %，接種量為8 %。分別對(duì)大豆肽的轉(zhuǎn)化率影響的4 個(gè)因素順序?yàn)椋篈（菌種比例）>B（溫度）>C（發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量）>D（總接種量）且菌種比例、發(fā)酵溫度和培養(yǎng)基的含水量3 個(gè)因素都具有顯著性。
2.3.3 驗(yàn)證試驗(yàn)
對(duì)最優(yōu)組合A2B2C1D2驗(yàn)證試驗(yàn)，作3個(gè)平行，結(jié)果取平均值，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果為65.08 %，同試驗(yàn)理論結(jié)果接近。
3討 論
本試驗(yàn)研究得出了兩步固態(tài)發(fā)酵豆粕的最佳工藝條件：以壓榨的豆粕為原料，并進(jìn)行60 目粉碎，首先試驗(yàn)選用的菌種為枯草芽孢桿菌和黑曲霉對(duì)豆粕進(jìn)行有氧發(fā)酵，確定最優(yōu)條件：發(fā)酵溫度是34 ℃，發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量是60 %，總接種量是10 %，發(fā)酵時(shí)間是72 h，菌種體積比例是3 ∶ 1。枯草芽孢桿菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生水解能力較強(qiáng)的蛋白酶，分解大分子物質(zhì)為小分子物質(zhì)，尤其在生長(zhǎng)代謝中產(chǎn)生的外肽酶，能夠?qū)Χ蛊芍械目嚯倪M(jìn)行分解。黑曲霉發(fā)酵豆粕的過程中能夠產(chǎn)生豐富的酶系，如酸性蛋白酶、果膠酶等，能夠更好的作用于豆粕，并且降解豆粕中的多糖，蛋白質(zhì)和細(xì)胞壁，進(jìn)而提高發(fā)酵豆粕的蛋白質(zhì)含量。然后對(duì)第一步發(fā)酵后的豆粕進(jìn)行再發(fā)酵，選用的菌種保加利亞乳酸桿菌和釀酒酵母進(jìn)行厭氧發(fā)酵， 確定最優(yōu)條件：溫度是36 ℃，發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量是40 %，總接種量是8 %，發(fā)酵時(shí)間是48 h，確定最優(yōu)條件菌種體積比例是2 ∶ 1。保加利亞乳酸菌和釀酒酵母菌在發(fā)酵豆粕的過程中，產(chǎn)生大量的有機(jī)酸，使豆粕的pH 值下將，有利于抑制有害微生物的生長(zhǎng)，同時(shí)又能進(jìn)一步分解大豆蛋白，提高大豆肽的濃度。經(jīng)過兩步發(fā)酵豆粕的大豆肽含量為26.42 %與大豆肽轉(zhuǎn)化率為65.08 %。此結(jié)果比劉天蒙等單菌發(fā)酵，李善仁等一步混菌發(fā)酵的效果更好。由此得出混菌發(fā)酵比單菌發(fā)酵豆粕效果好，兩步固態(tài)發(fā)酵比一步固態(tài)發(fā)酵豆粕效果好。此結(jié)論可為發(fā)酵豆粕生產(chǎn)大豆肽提供新的試驗(yàn)依據(jù)。
4結(jié) 論
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