生物法降解黃曲霉毒素 B1的研究進展

2020-10-21 10:53:26 點擊：

摘要：全世界約25%谷物供應受真菌毒素污染，給食品和飼料工業帶來巨大經濟損失，嚴重威脅著人類健康。因此，如何高效去除黃曲霉毒素（aflatoxin，AF）成為當今亟待解決的重大問題。生物法由于具有無污染、特異性高、溫和、環保等特點被廣泛關注。本文對生物法降解AF進行了闡述，重點介紹了微生物和昆蟲對AFB1的降解作用，并從降解酶、揮發性有機化合物及AFB1生物合成相關基因的表達論述了AFB1的降解機制，展望了生物法降解AFB1的存在問題及應用前景，為后續生物法降解AF提供理論依據。

據聯合國糧農組織估計，全世界25%的谷物供應受真菌毒素污染，其中2%的糧食由于發生霉變而不能食用。農作物污染給食品工業、飼料工業和畜牧業的發展帶來了重大問題，造成巨大經濟損失，已引起全球的廣泛關注。真菌毒素種類繁多，其中黃曲霉毒素（Aflatoxin，AF）是迄今發現農產品污染中毒性最強的一類生物毒素，對人類和動物具有極強的致突變、致癌和致畸性。玉米、小麥、高粱、花生餅、豆粕、棉籽粕、玉米秸稈等農產品因儲存不當或其他原因都會污染AF，這些原料經污染后，AF含量可高達50~80 μg/kg，遠高于中國規定的最高限量標準20 μg/kg。在動物生產中，一旦日糧（如小麥、麩皮、玉米、豆粕等）被AF污染，輕則導致動物體增重降低，飼料轉化率下降，重則誘發腫瘤和癌癥，甚至死亡，造成嚴重的經濟損失。人類攝入AF后，被細胞色素P450酶代謝形成活性中間體，與肝細胞相互作用引起肝癌。因此防止儲存過程中原料發生霉變是食品與飼料生產過程中的必要環節，同時對于已發生霉變的食品與飼料原料，如何高效去除AF就成為當今亟待解決的重大問題。本文對生物法降解AF進行了闡述，重點介紹了微生物和昆蟲對AFB1的降解作用及降解機制，為后續生物法降解AF提供理論依據。

1AF的去除

AF有二十多種，常見的有AFB1、AFB2、AFG1和AFG2。其中AFB1的毒性最強，因此被用來作為AF的評價指標。目前市場上常用的降解AF的方法主要有物理方法，化學方法和生物方法。物理法通過高溫加熱、紫外線照射等使AFB1結構破壞或通過吸附劑將AFB1吸附從而達到去除AFB1的效果。MARKOV等利用5-kGy γ-射線對47個污染的玉米樣品進行照射，AFB1去除率可達69.8%，而經10-kGy γ-射線照射后，AFB1的去除率提高到94.5%。物理法操作簡單，但是去除效率低且耗時?；瘜W法去除AFB1的方法包括強氧化劑和堿處理，通過打開AFB1的某些化學鍵從而達到去除效果。將污染AFB1的花生放置到臭氧發生器中，熏蒸60h后，檢測到89.4%的AFB1被降解。研究發現，弱堿高溫處理法對花生原料中AFB1有較好的去除效果，在121℃，pH10條件下將花生粕處理60min，AFB1降解率高達84.50%，將花生油在23.42%堿濃度下進行處理，AFB1濃度從34.78 μg/kg下降到0.37 μg/kg?；瘜W法操作簡單，去除效果佳，但化學試劑會嚴重破壞飼料的營養物質，對飼料造成二次污染。

生物法主要是利用微生物或酶制劑進行脫毒。FARZANEH等人分離出一株枯草芽孢桿菌UTBSP1（Bacillus subtilis UTBSP1），該菌株可以降解肉湯培養基中AFB1，降解率達到85.66%。TOPCU等研究了屎腸球菌（Enterococcus faecium）降解AFB1的能力，發現在培養48h后，大約有40%的AFB1被降解。生物降解法是目前最環保最高效的降解方法，不僅可以有效降解毒素，還能提高飼料或食品的營養價值，不會造成二次污染。

2生物法降解AFB1

2.1 微生物對AFB1的降解作用

微生物法降解AFB1已經逐漸成熟，近幾年，發現多種微生物對AFB1具有顯著的降解作用。例如，嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）、施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、藤黃單胞菌（Luteimonas sp.）、泉水單胞菌（Silanimonas sp.）、溶桿菌（Lysobacter sp.）、乳酸桿菌（Lactobacillus sp.）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）和紅串紅球菌（Rhodococcus erythropolis）等等。大多數研究者通過高通量如香豆素平板篩選出解毒效率高的優勢菌株，表1為降解AFB1的部分菌株。

2.1.1 細菌對AFB1的降解作用

利用細菌對AFB1進行高效降解是解決AF污染的一大研究熱點。WAN等觀察到地衣芽孢桿菌BL010（Bacillus licheniformis BL010）具有較高的AFB1降解活性，是一種高效的AFB1降解菌株。SHU等利用香豆素培養基分離到一株具有較強AFB1降解活性的細菌，鑒定為芽孢桿菌DY3108（Bacillus velezensis DY3108），進一步研究中發現其AFB1降解活性主要來源于菌株無細胞上清液，對蛋白酶K處理具有熱穩定性和抗性，對十二烷基硫酸鈉處理具有敏感性，耐高溫且最適pH值寬泛。KARUNARATNE等測定了三種乳酸桿菌（Lactobacillus p.）對黃曲霉菌生長和AF產生的影響，結果表明三種乳酸桿菌能有效地抑制黃曲霉菌的生長，并能有效地減少AF的產生。SANGI等分離出5株AFB1降解菌株，分別為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）、兩株擬灰色赭桿菌（Ochrobactrum pseudogrigonens）、銅綠假單胞菌（Pseudomon asaeruginosa）和陰溝腸桿菌（Enterobacter cloace），降解活性分別達到88%、78%、61%、58%和51%，這是首次證實了短小芽孢桿菌（Bacillu spumilus）對AFB1的降解，并首次報道了擬灰色赭桿菌（Ochrobactrum pseudogrigonens）和陰溝腸桿菌（Enterobacter cloace）具有AFB1降解活性。XU等測定了從玉米、水稻和土壤樣本中采集的43個細菌菌株的AFB1降解活性，分離出活性較高的菌株L7，鑒定為沙克氏桿菌（Bacillus shackletonii）。MWAKINYALI等發現擬香味類香味菌3J2MO（Myroides Odoratimimus strain 3J2MO）能很好地降解AFB1，采用高效液相色譜-熒光檢測法測定AFB1的含量，結果表明，在37℃LB培養基中培養48h后，約93.82%的AFB1被降解，該菌在農產品和食品工業基質中都有潛在的AF污染生物防治策略的生物修復和解毒作用。CHLEBICZ等研究了12株乳酸桿菌和6株釀酒酵母對AF的降解作用，乳酸桿菌平均解毒效率為60%，酵母平均解毒效率為65%。WANG等從雞盲腸篩出一株具有AFB1降解能力的菌株，用高效液相色譜法測定AFB1降解率為93.7%，經16SrDNA基因序列分析和多重PCR鑒定為非致病性大腸桿菌CG1061（Escherichia coli CG1061）。細菌是AFB1降解菌株的主力軍，但是其研究內容較為簡單，只是研究了降解率、最適溫度、最適pH和有效降解成分的性質，因此對細菌降解機理的還需要進一步研究。

2.1.2 真菌對AFB1的降解作用

真菌降解AF對發酵生產和飼料利用更具實際應用價值。降解AF的真菌主要包括雜色云芝（Trametes versicolor）、白腐真菌（Phanero chaete）和黑曲霉（Aspergillus niger）等。DAS等將發霉的秸稈與不同菌株進行共培養，利用高效液相色譜法測定AFB1的降解程度，發現黃曲霉MTCC2798與糙皮側耳菌GHBBF10（Pleurotus ostreatus GHBBF10）共培養時，AFB1降解率可達89.41%，該菌株可進一步開發，有效降解發霉稻草中的AFB1。GHANBARI等研究了乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis）對黃曲霉菌生長的影響，發現在30℃下孵育7d，酵母最低群體濃度為1.5×105CFU/ml時，乳酸克魯維酵母抑制了黃曲霉的生長，并使AF的總產量降低了97.9%，其中AFB1、B2、G1、G2分別降解了97.8%、98.6%、98%和94%。WANG等對白腐菌（Phanerochaete sordida）進行研究，發現該菌可去除86.0%的AFB1。與細菌降解相比較，大多數真菌存在降解AFB1時間長、操作繁瑣和降解率低的問題，大大限制了真菌在工業上的實際應用。LI等利用黑曲霉（Aspergillus niger）降解AFB1，利用液相色譜法測定AFB1含量，結果表明在處理72h后，黑曲霉對AFB1的降解率高達93.28%，其中在12h時，降解率已達到63.48%，分離菌體細胞與胞外粗提液，分別測定降解能力，發現胞外粗提液AFB1降解能力最強（84.20%），推測是由于黑曲霉細胞壁的吸附作用、胞內物質的降解作用共同去除AFB1。ZJALIC等凍干不同的雜色云芝（Trametes versicolor）提取液，通過一系列步驟提取胞外多糖和糖蛋白，添加到寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）的液體培養基中，對寄生曲霉的菌絲生長和AF的產生進行分析，結果表明其中一株雜色云芝在9d完全抑制了分生孢子的萌發和曲霉菌絲的生長，另外兩株在3-6d內起抑制作用。

2.2 昆蟲對AFB1的降解作用

昆蟲作為一種營養豐富、高效、可持續的動物蛋白和熱量來源，越來越受到人們的關注。一些昆蟲由于其在特殊的自然環境下生長繁殖，能夠以受到霉菌毒素污染的營養食物為能源，因此在昆蟲進化過程中已經對霉菌毒素以及其它毒素產生了應對能力。NIU等發現臍橙螟對AFB1赭霉毒素A具有極高的耐受性，推測其耐受性可能是由于昆蟲的解毒能力，產生了無毒的代謝產物。VAN等發現未受污染飼糧處理的黃粉蟲幼蟲與受污染飼糧處理的黃粉蟲幼蟲體重增加無差異，且存活率都較高，用LC-MS/MS分析了幼蟲和幼蟲糞便中霉菌毒素的存在情況，都未檢出受污染飼糧或受污染飼糧衍生物，說明霉菌毒素被幼蟲降解。NIERMANS等發現玉米烯酮不會在黃粉蟲的幼蟲體內積累，并且黃粉蟲能夠代謝和排泄霉菌毒素，其降解產物主要是玉米烯酮的偶聯物。CAMENZULI等在黑蠅蟲和黑蠅幼蟲的飼料中添加AFB1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Fusarium oxysporum enol,DON）、赭霉毒素A（Ochatoxin A,OTA）和玉米赤霉烯酮（Zearalenone,ZEN）的混合物，其濃度分別為歐盟委員會規定的完全飼料最高濃度的1倍、10倍和25倍，所有霉菌毒素均未在幼蟲體內積累，質量平衡計算表明黑蠅蟲和黑蠅幼蟲對四種霉菌毒素有不同程度的代謝，其代謝物為黃曲霉毒醇，AFP1，AFQ1和AFM1，3-乙酰-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（3-acetyl-DON）,15-乙酰-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（15-acetyl-DON）和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇-3-糖苷（DON-3-glycoside），α-和β-玉米赤霉烯。BOSCH等研究表明，用添加AFB1的家禽飼料喂養黑水虻幼蟲和黃粉蟲幼蟲，其飼料中AFB1濃度分別為0.01、0.025、0.05、0.10、0.25和0.5mg/kg，對黑水虻幼蟲和黃粉蟲幼蟲的存活率和體重沒有影響，結果表明黑水虻幼蟲和黃粉蟲幼蟲均具有較高的AFB1耐受性，且不積累AFB1。此外，黃粉蟲對惡劣的生活環境適應性極強。楊軍等發現黃粉蟲能夠將聚苯乙烯塑料完全降解礦化為CO2或同化為蟲體脂肪，且以聚苯乙烯為食的黃粉蟲的存活率與對照組無明顯差別，首先黃粉蟲將聚苯乙烯咀嚼成小碎片，并攝入腸道，攝入的片段與腸道微生物區系混合，腸道微生物區系分泌細胞外酶，催化片段解聚成小分子產物，從黃粉蟲腸道篩選出一株能夠將聚苯乙烯塑料作為唯一的生長營養物質的細菌，命名為微小桿菌YT2（Exiguobacterium YT2），該菌株被證實能夠降解聚苯乙烯，說明腸道菌群在黃粉蟲降解外源物質的過程中發揮著重要的作用一。

3生物法降解AFB1的機制

AFB1結構式中含有一個雙呋喃環和一個氧雜萘鄰酮，有研究表明前者為發揮毒性作用的主要基團，而后者主要與致癌性有關。目前關于物理法和化學法對AFB1降解機理的研究報道較少，大多數報道只是利用液相與質譜聯用測定AFB1降解產物分子式，二級質譜對比庫或利用軟件推測降解產物結構式，根據產物結構分析出AFB1降解途徑，而涉及生物降解AFB1機理的相關報道較多，主要包括酶降解AFB1，揮發性有機化合物對AFB1的影響，AFB1相關基因的表達等。

3.1 酶降解AFB1

酶作為AFB1降解機制研究中起催化作用的主要組成，在AFB1的生物法降解研究中占據了重要地位。WANG等利用白腐菌YK-624（Phanerochaete sordida YK-624）的錳過氧化物酶（Manganese peroxidase，MnP）對AFB1進行處理，發現86%的AFB1被去除，通過UMU試驗（DNA損傷物誘導SOS反應表達umuC基因的能力）得知MnP顯著降低了AFB1的致突變活性，而20 nkat MnP處理AFB1即可使其誘變活性降低69.2%，如圖1所示，H-NMR和HR-ESI-MS分析表明，AFB1首先被MnP氧化成AFB1-8,9-環氧化物，然后水解成AFB1-8,9-二氫二醇，這是首次報道MnP通過將AFB1轉化為AFB1-8,9-二氫二醇來有效去除AFB1的致突變活性。WAN等在對地衣芽孢桿菌BL010（Bacillus licheniformis BL010）的研究中發現并證明了其無細胞提取物在AFB1的降解中起重要作用，利用生物信息學方法發現了兩個降解酶基因漆酶和幾丁質酶基因（Lac010和Chia010），對Lac010和Chia010中的保守位點和可變位點進行多重序列比對，以確定在蛋白水平上的序列相似性，分析確定了這兩種酶的二級結構，為后續的同源性建模和功能預測提供了重要依據，對Lac010和Chia010構建了系統發育樹，結果表明Chia010與地衣芽孢桿菌幾丁質酶的遺傳距離較短，Lac010與枯草芽孢桿菌亞種之間的遺傳距離較短。XU等在對沙克氏桿菌L7（Bacillus shackletonii L7）的研究中發現，其上清液對AFB1的降解率高于活細胞和細胞提取物，在蛋白酶K（ProteaseK）和十二烷基硫酸鈉（SDS）存在下，AFB1降解率有所下降，從煮沸上清液中純化出一種耐熱酶，稱為AF降解酶，這也是首次報道了從沙克氏桿菌中分離出的一種AF降解酶，它在食品和飼料加工中對AF的解毒具有潛在的應用價值。SONG等對M19型銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa M19）降解AF進行了研究，發現分別添加蛋白酶K、SDS和加熱后，銅綠假單胞菌M19培養上清液的降解能力顯著降低，推測存在AF降解酶，采用硫酸銨分步沉淀、離子交換層析和凝膠過濾層析三步程序從假單胞菌中分離出AF降解酶，使其成為一種很有前景的AFB1生物降解候選物。XIE等利是用二乙氨基乙醇-瓊脂糖色譜法從泛生菌T6（Pantoea sp.T6）上清液中分里出一種胞外酶，命名為AF降解酶，用質譜法鑒定為外膜蛋白A，這是首次報道泛生菌T6可以分泌外膜蛋白A出膜并降解AFB1。

3.2 揮發性有機化合物對AFB1的影響

文獻報道表明，揮發性有機化合物（Volatile organic compounds,VOCs）對真菌病原菌具有顯著的抗真菌活性。一些微生物通過揮發性有機化合物的釋放，如鏈霉菌和芽孢桿菌等，對植物病原菌顯示出巨大的潛在生物作用。YANG等研究了鏈霉菌TD-1（Streptomyces alboflavus TD-1）中揮發性有機化合物對黃曲霉的抑菌作用，利用兩個面對面無蓋培養皿，將鏈霉菌TD-1置于下方，黃曲霉菌置于上方，結果發現揮發性有機化合物對黃曲霉菌絲生長、產孢和孢子萌發有較強的抑制作用，此前關于利用鏈霉菌揮發性有機化合物抑制黃曲霉的報道很少。LYU等在對鏈霉菌3-10（Streptomyces yanglinensis 3-10）的研究中也發現了可揮發性有機化合物在體外能抑制黃曲霉和寄生黃曲霉的菌絲生長、產孢、孢子萌發和AF生物合成基因的表達，通過掃描電鏡觀察表明，高劑量的可揮發性化合物可抑制兩種曲霉菌在花生籽粒上的分生孢子萌發和定殖，采用固相萃取-氣相色譜-質譜聯用儀對19種主要揮發性有機物進行了檢測，發現其中2-甲基異莰醇是主要揮發性成分，2-甲基丁酸甲酯、2-苯乙醇和β-石竹烯等3種標準化學物質對黃曲霉和寄生曲霉均具有抗真菌活性，其中2-甲基丁酸甲酯對黃曲霉和寄生曲霉孢子萌發的抑制作用最強，這是2-甲基丁酸甲酯對黃曲霉和寄生曲霉抗真菌活性的首次報導。BOUKAEW等采用同樣的方式在PDA平板上上進行抗真菌生物測定，結果表明鏈霉菌RL-1-178（Streptomyces philanthi RL-1-178）對寄生曲霉TISTR 3276（Aspergillus parasiticus TISTR 3276）和黃曲霉PSRDC-4（Aspergillus flavus PSRDC-4）表現出抑制作用（圖2），通過氣相-質譜聯用檢測鑒定出39種化合物，其中含量最多的物質是土臭（3.75%），其次是41種L-芳樟醇（13.55%），2-巰基乙醇（9.71%）和庚烷（5.96%）。土臭素，L-芳樟醇和2-巰基乙醇完全抑制了菌絲體的生長，庚烷的抑制作用僅為45.7%。在儲存的大豆種子上使用可揮發性化合物作為生物熏蒸劑，可以完全保護種子免受感染，并完全抑制AFB1、B2和G2的產生，這些發現表明，揮發性有機化合物可以用作生物熏蒸劑，以抑制儲存的種子中兩種真菌的生長和AF的生成。由于揮發性有機化合物的特性，有關其降解AFB1的研究逐漸增加，可揮發性有機化合物將成為生物法降解AFB1的一大熱點。

3.3 AFB1生物合成基因的表達

生物法降解AFB1的研究深入到基因層面。GHANBARI等人將乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis）與寄生霉菌共培養，采用實時PCR方法分析了乳酸克魯維酵母孵育48h后β-actin和轉錄調控因子aflR mRNA的表達水平，β-actin結果表示寄生曲霉在乳酸克魯維酵母存在下表現出穩定性，同時發現用1.5×105 CFU/ml濃度的乳酸克魯維酵母處理后，轉錄調控因子aflR基因表達明顯下降（P<0.05），表明乳酸克魯維酵母能夠抑制黃曲霉菌生物合成基因的表達。YANG等通過實時熒光定量PCR測定在揮發性有機化合物的影響下，AF生物合成的基因表達變化，結果顯示在鏈霉菌TD-1（Streptomyces alboflavus TD-1）的可揮發性有機化合物處理下，LaeA和vea表達較對照組下降5.46倍和29.50倍，兩個關鍵的轉錄調控因子aflR和aflS分別下調了6.98倍和19.27倍，并且其他四個結構基因aflD、aflM、aflP和aflQ在7.35-35.59倍范圍內下調，表明可揮發性有機化合物通過影響AF生物合成的相關基因表達，直接降低AF的產生。通過研究黃曲霉菌內一系列合成AF基因的表達，揭示生物法降解AF的機理，為生物法的進一步研究奠定了基礎，為基因改造降解AF的菌株提供了新的思路。

4展望

生物法由于其無污染、具有特異性高、溫和、環保等優點成為近年來AF降解研究領域的熱點。微生物降解AF成為研究的主要方向，但是目前報道的絕大多數微生物脫毒菌種在實際應用中存在如下兩方面的共性問題：（1）有部分微生物對AFB1起吸附作用，通過食物鏈循環進入動物或人體，在體內發生解吸附作用，從而使AFB1進入動物或人體，造成傷害，此類微生物并沒有實現生物降解，無脫毒意義；（2）已報道的菌種對AF的脫毒時間一般都在72h左右，脫毒時間較長，而且降解效率普遍較低，實踐意義和應用價值不大。因此，需要尋找能夠高效降解AF的菌種，真正應用到農業生產和食品安全領域。

目前，關于AF降解酶報道相對較少，大多數酶的降解率不高且用時長，導致毒素不能被完全降解。因此，利用基因工程的手段對微生物菌種進行篩選及改造，獲得降解酶在體外的高效表達，開發出能夠高效降解AF的生物菌種，進而為實現農作物資源的無毒化和高值化利用提供技術支持，為進一步推進我國食品與飼料安全奠定基礎。

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