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乳酸菌（Lactobacillus）是發酵糖類且主要產物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細菌的總稱，乳酸菌廣泛存在于自然界和人畜的消化系統中，幾乎所有菌都對人和動物無毒、無害，可以促進人和動物的健康，由于具備多種益生功能，使其在醫藥、生物技術、食品、飼料等領域得到了廣泛的應用。截止2010 年， 我國乳酸菌產業規模已經超過200 億元，產量突破160萬噸。在養殖業，由于抗生素的使用日漸威脅人類的健康和環境安全，世界各國已普遍禁用或限用飼用抗生素，與之相反，微生物飼料添加劑在畜禽養殖業中已經得到廣泛的認可和使用，其中最受推崇的就是乳酸菌。乳酸菌在動物體內能發揮許多的生理功能，它們能促進動物生長，調節胃腸道正常菌群、維持微生態平衡，改善胃腸道功能；提高食物消化率和生物效價； 降低血清膽固醇，控制內毒素；抑制腸道內腐敗菌生長，提高機體免疫力，防治多種腸道疾病。2008 年12 月我國農業部1126 號公告《飼料添加劑品種目錄（2008）》中規定的可以直接飼喂動物的飼料級微生物添加劑菌種，共16 種：地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、兩歧雙歧桿菌（Bifidobacteriumbifidum）、糞腸球菌（Straptoccus faecium）、屎腸球菌（Enterococcus lactis）、乳酸腸球菌（Lactobacillus acidophilus）、嗜酸性乳桿菌（Lactobacillusacidophilus）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、乳酸乳桿菌（Lactobacillus lactis）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、乳酸片球菌（Pediococcusacidilacticii）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、產朊假絲酵母（Candida utilis）、釀酒酵母、（Saccharomycescerevisiae）、沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonaspalustris）、保加利亞乳桿菌（Lactobacillusbulgaricus），其中11 種為乳酸菌。

盡管乳酸菌在養殖業中的意義重大，但其生物飼料添加劑的規模還是比較小，目前市場份額大約為10 億元左右，這主要是因為目前乳酸菌的研究和應用更多地集中在發酵乳制品（益生菌酸奶、益生菌發酵乳飲料、益生菌奶酪）、發酵豆乳制品、功能性食品配料和食品添加劑（如在嬰兒配方乳粉、中老年乳粉、果汁等中的添加等）、膳食補充劑（片劑、膠囊等）等方面，研究的方向集中在發酵菌劑的研制和使用等方面，由此，也造成了乳酸菌飼料添加劑研發的滯后。要為消費者提供更多健康的肉類食品，必須加快飼用乳酸菌工業化生產的研究。目前情況下，乳酸菌飼料添加劑的規模化生產需要解決如下三個問題：一是原料廉價易得，最好是廢棄的農副產品；二是工藝要低碳環保，盡量減少能源消耗和二次污染；三是操作簡便，不需要添加外源物質，就能生產出高密度的乳酸菌。為此，研究者們作出了不懈努力，如劉曉紅等以玉米粉、麥麩等為固態基質,對一株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）進行了固態混合發酵試驗， 培養結束后乳桿菌活菌數可達100.5×108CFU/g（鮮基）；方芳等以玉米粉、豆粕、麥麩為基質對保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌進行固態混合發酵， 在40℃時得出最好發酵結果，各菌活菌數在109CFU/g 以上。許贛榮等則發明了一種利用糖渣培養乳酸菌及生產乳酸活菌飼料的方法，以玉米淀粉制糖工業副產物糖渣為主要原料，添加麩皮、蛋白胨等物質，并采用固態分批、液態分批、或液態補料的方式， 液態培養活菌含量109CFU/mL以上， 固態培養活菌含量109CFU/g 以上的乳酸菌劑。但是，對照規模化生產需要解決的三個問題，上述研究離工業化生產的要求還有一定距離。在我國，每年都有數以萬噸計的菠蘿渣、羅漢果渣、燒仙草渣、馬蹄淀粉廢水、馬蹄渣等農產品加工廢棄物，量大而且相對集中，對其進行資源化利用，意義十分重大。本文研究了植物乳桿菌對上述農副產品廢棄物的利用情況，同時發現了一種利用馬蹄淀粉廢水、馬蹄渣生產乳酸菌飼料添加劑的方法。

1.1 材料

1.1.1 菌種

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），本實驗室分離保存，標記為LP199。菌劑為干粉，活菌含量400B/g。

1.1.2 各種農副產品廢棄物

菠蘿渣：菠蘿經壓榨機壓榨取汁后的果渣，取自合浦果園香公司；

羅漢果渣：鮮羅漢果經浸提壓榨后的果渣，主要為羅漢果核，取自桂林某公司；

燒仙草渣：燒仙草干草經浸提后的草渣，取自廣西宇峰公司；

馬蹄淀粉廢水：馬蹄經勻漿、去渣和流槽沉淀后的廢水，取自廣西某公司；

馬蹄渣：馬蹄勻漿經漿渣分離再作壓濾后之渣，取自廣西某公司。

1.2 方法

1.2.1 可資利用農副產品廢棄物的快速篩選

取植物乳桿菌菌劑0.4g， 加入1000mL 滅菌生理鹽水中，混勻，制得1×108CFU/mL 的菌種液。將菌種液按1∶10 的比例分別接種到下列試驗編號的樣品中：

1#：450g 菠蘿渣，加450mL 蒸餾水，置1000mL廣口瓶中；

2#：450g 羅漢果渣，加450mL 蒸餾水，均質，置1000mL 廣口瓶中；

3#：450g 燒仙草渣，加450mL 蒸餾水，均質，置1000mL 廣口瓶中；

4#：900mL 馬蹄淀粉廢水，置1000mL 廣口瓶中；

5#：450g 馬蹄渣，加450mL 蒸餾水，置1000mL廣口瓶中。

接種后，密封置30℃發酵，24h 后，做感官、菌相鏡檢及pH 值測定，其中pH 用檢定合格的pH 計測定。上述樣品同時另備一份，相應編號為A、B、C、D、E，做發酵前的感官、菌相鏡檢及pH 值測定。選取發酵后色澤、氣味較好，革蘭氏陽性短桿菌較多且純，pH 值較低的樣品作為植物乳桿菌可資源化利用的基質。

1.2.2 LP199 對選用基質營養成分的利用實驗

對篩選出的基質，重復上述試驗，同時檢測其發酵前后的總糖、蛋白質、總酸（以乳酸計）、乳酸、脂肪、淀粉、粗纖維、膳食纖維等營養成分，分析其前后之變化。各成分的檢測分別按GB/T 5009.8-2008、GB 5009.5-2010、GB/T 12456-2008、SN/T 2007-2007、GB/T 5009.6-2003、GB/T 5009.9-2008、GB/T 5009.10-2003、GB/T 5009.88-2008 等方法進行。

對固體廢渣再做氨基酸檢測， 分析其發酵前后之變化。氨基酸的檢測按GB/T 5009.124-2003方法進行。

1.2.3 利用選擇基質生產乳酸菌劑的試驗

試驗前，先在現場取樣，測可溶性固形物，測pH值，鏡檢，檢測菌落總數。可溶性固形物用手持式折光儀直接讀數，菌落總數按GB 4789.2-2010 檢測。試驗時，先將植物乳桿菌菌種液按1∶10 的比例直接接入基質中過夜進行一級放大， 然后再按同樣的比例接種進行培養，發酵24h 后，鏡檢，感官檢查，測pH 值，測乳桿菌數，同時作對照試驗。

2.1 可資利用農副產品廢棄物的快速篩選結果

用植物乳桿菌LP199 對菠蘿渣、羅漢果渣、燒仙草渣、馬蹄淀粉廢水、馬蹄渣等進行了發酵試驗，結果如表1 所示。

本試驗所用的菌種LP199，為一種植物乳桿菌，系革蘭氏陽性桿菌， 分散排列， 菌體大小為0.8-1.0μm×1.0-2.0μm。從表1 中可以看出，植物乳桿菌在菠蘿渣中未能占據主導地位， 大量生長的是一種革蘭氏陽性鏈桿菌；羅漢果渣發酵后總體菌量較少，并且酵液發臭； 燒仙草接種培養后呈現混合菌相，pH 值未能顯著下降，并且出現產氣和腐爛味；因此上述三種廢渣均不適合作為生產乳酸菌劑的基質。而馬蹄淀粉廢水和馬蹄渣發酵后，pH 值迅速下降，具有特殊發酵的酸香味，菌體主要為植物乳桿菌，所以本研究首先選取此兩種物質作為培養植物乳桿菌的基質。

2.2 LP199 對馬蹄淀粉廢水和馬蹄渣營養成分的利用結果

將LP199 接種于馬蹄淀粉廢水和馬蹄渣后，檢測其發酵前后之總糖、蛋白質、總酸等營養成分，結果如表2 所示。

從表2 中可以看出，發酵后，總糖接近零值，而總酸大大增加。總酸成分主要為乳酸，如馬蹄淀粉廢水中乳酸/總酸比值為82%， 馬蹄渣中乳酸/總酸比值為98%，說明LP199 是行同型乳酸發酵，如此高濃度的乳酸足以將其它細菌抑制或殺滅， 這為其免于對基質的熱處理從而實現低碳發酵奠定了基礎。發酵前后，蛋白質、脂肪、淀粉的含量沒有明顯變化，提示LP115 和其它大多數乳酸菌一樣，缺乏這些物質的分解酶系， 其生長所需因子主要來源于馬蹄淀粉廢水和馬蹄渣中已有的營養物質， 同時也說明此廢水和廢渣利用前景廣闊。

本實驗同時檢測的還有馬蹄渣發酵前后氨基酸含量，結果如表3 所示。

從表3 中可以看出，經LP199 發酵后，馬蹄渣中的氨基酸由4.400g/100g 增加到了5.743g/100g，總量增加了30.5%。個例氨基酸中， 只有胱氨酸減少，其余全部增加，增加50%以上的有谷氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸和精氨酸，其中后5 種氨基酸為畜禽必需氨基酸。氨基酸的變化反映出植物乳桿菌LP199 復雜的生理代謝作用，由于氨基酸本身就是乳酸菌的良好底物， 所以發酵后氨基酸的增加可能來源于菌體的增加， 提示LP199菌體是一種優良的單細胞蛋白。

2.3 馬蹄淀粉廢水、馬蹄渣生產乳酸菌劑的試驗結果

將菌種放大一級后再分別接種于馬蹄淀粉廢水和馬蹄渣，自然環境條件下密封放置，試驗結果如表4 所示。本試驗于2012 年12 月23 日和2013 年2月1 日在生產現場進行了兩次， 日平均氣溫20-15℃，結果為兩次試驗的平均數。

從表4 中可以看出， 馬蹄淀粉廢水和馬蹄渣基質中，含有一定的雜菌，數量在106CFU/mL（g）以上，主要是一些革蘭氏陽性小球菌， 如果不接種LP199，24h后， 該菌就會大量繁殖， 菌體密度達到109CFU/mL（g）以上。而接入10%的LP199 一級放大菌液后，LP199 的生長居于主導地位，培養液中幾乎全為植物乳桿菌，由于沒有其它外源菌，表中乳桿菌的量就是LP199 的量，它在馬蹄淀粉廢水中的純度是91.7%，在馬蹄渣中的純度則幾乎是100%，而且密度較高，活菌數在109CFU/mL（g）以上。

由于目前我國還沒有乳酸菌菌劑的國家或行業標準，如果以農業部光合細菌菌劑的標準作為生物菌劑的判定依據， 則可發現本試驗得到的乳酸菌菌劑數量的雜菌率均滿足其要求， 是一種優良的生物飼料添加劑， 特別是馬蹄渣中還含有大量的膳食纖維（見表2），更顯其作為飼料添加劑的優越性。

本文研究發現了一種利用馬蹄淀粉廢水、馬蹄渣生產植物乳桿菌飼料添加劑的新方法， 該方法具有原料廉價易得、工藝低碳環保、操作簡便可行的特點，由此生產的生物飼料添加劑可廣泛應用于畜禽、水產養殖。

植物乳桿菌屬于乳桿菌屬（Lactobacillus），其營養要求比較復雜，需要氨基酸、核酸衍生物、維生素和可發酵的糖等，因此，并不是所有的農副產品廢棄物都可被其利用，如菠蘿渣、羅漢果渣、燒仙草渣就不適用，實際上，還曾做過廢棄柑橘和廢棄柿子的研究，二者更難被利用；研究發現，馬蹄淀粉加工的廢棄物是培養植物乳桿菌LP199 的優良基質。馬蹄淀粉加工過程中產生的廢水、廢渣， 可溶性固形物達1.5-2.0%，實際上可看作是馬蹄勻漿的上清液（因廢渣含水量也達到79.6%），其中蘊含著豐富的營養物質，非常適合植物乳桿菌的生長，植物乳桿菌接種到馬蹄淀粉的廢水廢渣后，能迅速增殖，產生大量的乳酸，使pH 值降低到4.0 以下，抑制和殺滅其它微生物，使雜菌率控制在10%以內，這一培養特性正可以用于生物飼料添加劑的工業化生產， 因其不需要添加任何外源物質，不需要任何熱處理措施，甚至可以做到零排放。

馬蹄渣更有利于植物乳桿菌LP199 的增殖，與馬蹄淀粉廢水相比，不僅活菌含量更高，而且菌物更純，純度幾乎是100%。有趣的是，馬蹄渣接種植物乳桿菌LP199 培養后，其氨基酸含量增加了30.5%，這可能歸結于菌體蛋白的增加， 提示菌體本身可作為高質量的單細胞蛋白，不過，由于氨基酸的總含量不高， 所以其意義更多地在于植物乳桿菌的大量增殖可使之足以達到發揮對動物的益生作用， 同時通過改善馬蹄渣的營養成分，增加其適口性，從而增加其作為生物飼料添加劑的性價比。

采用一級放大，二級10%的接種量，自然環境條件下直接培養，無需任何特殊的工藝，即可將馬蹄淀粉廢水和馬蹄渣變為活菌含量109CFU/mL（g 鮮重）以上的乳酸菌飼料添加劑。由于乳酸菌對環境敏感，不易保存，因此，還需對其活性保存條件作進一步研究。

以年產2.0×106kg 馬蹄淀粉來計，馬蹄淀粉廢水、馬蹄渣量將分別達到1.2×107kg 和4.5×106kg 左右，其量大，而且相對集中，因此對其進行資源化利用生產乳酸菌飼料添加劑，前景廣闊，同時馬蹄濕渣中還含有13.5g/100g 的膳食纖維， 折合干基含量為67.6g/100g，這將大大增加其作為生物飼料添加劑的潛在價值。