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乳酸菌是一類能夠發酵利用糖產生乳酸的細菌統稱。一般乳酸菌不易存活，對環境的抗逆性差，不能夠耐高溫，耐酸和耐膽鹽，因此乳酸菌制品普遍存在著保存性差、易失活等缺點。

凝結芽孢桿菌是一類能夠形成芽孢的乳酸菌，它除了具有一般乳酸菌的維持腸道微生態平衡，提高機體消化功能和健康水平外，還具有耐高溫，耐酸、耐膽鹽等優點，能有效抑制有害菌的生長，改良腸道微生態環境，促進腸道發育，增強腸道功能，在飼料行業有很好的應用前景，被美國食品與藥物局（FDA）列入可用于飼料的安全微生物菌種名單。由于凝結芽孢桿菌的芽孢具有易保藏、復活率高等特點，因而是乳酸菌商品化制劑的重要形式。目前如何通過培養條件調控，使凝結芽孢桿菌的產芽孢率提高是研究重點。本文在前期篩選獲得一株凝結芽孢桿菌B2的基礎上，嘗試采用液態發酵方式，通過PB試驗設計優化其培養基組成及培養條件，以期進一步提高凝結芽孢桿菌的產芽孢數，為后期制劑的大規模生產提供數據依據。

1.1 材料

菌種：凝結芽孢桿菌B2為本實驗室篩選，于-20 ℃保存。

發酵培養基：YPD培養基，成分為葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母浸粉10 g，加水至1 L，pH值7.0，115 ℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化

將保存的菌種轉接到種子培養基，37 ℃培養24 h,備用。

1.2.2 種子液的制備

從斜面上挑取一環培養物接種到裝有20 ml 培養液的50 ml 三角瓶中，于30 ℃、220 r/min條件下震蕩培養24 h，備用。

1.2.3 發酵培養

將上述種子培養液按1%的接種量接種于發酵培養基，裝液量100 ml，于30 ℃、220 r/min條件下搖瓶培養48 h。

1.2.4 培養基的單因素試驗

首先通過PB試驗確定影響芽孢得率的顯著培養基成分，再通過對顯著成分的單因素試驗，確定其最佳添加量。

1.2.5 培養條件的優化

在獲得最佳培養基的基礎上，對接種量以及發酵模式（震蕩、靜置）進行逐一優化。

1.2.6 計數方法

凝結芽孢桿菌的活菌總數采用稀釋平板計數法；芽孢計數則采用把培養后菌液于80 ℃水浴15 min后稀釋涂平板計數。

2.1 不同培養原料對液體發酵產芽孢能力的影響

在試驗過程中發現凝結芽孢桿菌B2在若干培養基平板上有產芽孢的能力，其中以加入淀粉的平板產芽孢最早，在24 h產生，以加入蛋白胨的平板為最高，因此，綜合考慮，我們選擇幾種工業上發酵罐中常用的碳氮源作為PB實驗的篩選因子，具體方案和結果見表1。結果分析見表2。

由表2可知，試驗模型的R²值為0.91，表明實驗有91%的數據能夠用此模型擬合，模型情況較好。Shapiro-Wilktest表明數據符合正態分布。同時由表2可見，各因素的作用顯著性排序為：蛋白胨>淀粉>大豆粉>葡萄糖>酵母膏>K₂HPO₄>(NH₄)₂SO₄。其中顯著的因素為蛋白胨、大豆粉和淀粉。

2.2 凝結芽孢桿菌芽孢形成培養基的確定

根據2.1 節所獲得的結果，我們選擇了蛋白胨、淀粉和大豆粉等3個因素為考察對象，其余因素取低水平。對此3因素進行單因素實驗，摸索它們的最佳添加量。

由表3可知，淀粉最佳的添加量為0.2%、蛋白胨最佳添加量為0.5%、大豆粉最佳添加量為1.0%，結合2.1節的結果，確定凝結芽孢桿菌發酵產芽孢的最佳培養基為淀粉0.2%、蛋白胨0.5%、大豆粉1.0%、葡萄糖0.1%、酵母膏0.07%、MnSO₄0.02%。

2.3 接種量的單因素實驗

在確定發酵培養基的基礎上，進一步研究了初始種子接種量對發酵后芽孢數的影響，結果見表4。

由表4可知，隨著初始種子接種量的增加，發酵后的芽孢數量也逐步提高，考慮到生產實際，合理的接種量應該控制在3%~5%。

2.4 不同的培養方式對凝結芽孢桿菌芽孢得率的影響

研究表明，提高通氣量有助于凝結芽孢桿菌轉變為芽孢，而靜置培養又可提高初始菌數。因此我們選取了3種不同的作用方式，結果見表5。由表5可知，最佳的培養方式為連續搖瓶的方式，在此條件下，芽孢數量可以達到3.5×10⁸ cfu/ml。

隨著微生態制劑研究成為飼料添加劑研究的熱點，乳酸菌在動物飼養中的優勢逐步顯現。但絕大多數乳酸菌存在抗逆性差，不耐熱的缺點，給制劑的保藏、運輸都帶來了較大困難，由于無法保證產品有效性，無法直接添加到配合飼料中使用。芽孢桿菌由于芽孢的生成，具有抗逆性強、耐高溫和易儲存等特點，很好地彌補了乳酸菌的不足，因而產乳酸芽孢桿菌的研究已成為益生菌菌株研發的熱點。許多研究報道，凝結芽孢桿菌在源缺乏的情況下才會形成芽孢，在碳源充足的情況下不形成芽孢，菌體會發生自溶。同時無機鹽在調控芽孢形成中發揮重要的作用，Mn²⁺對芽孢形成起到顯著的影響，PO₄^3-也有利于芽孢的形成，而K⁺ 和Na⁺對凝結芽孢桿菌的形成無明顯的促進作用。

本試驗通過研究表明最佳液體發酵培養基為淀粉0.2%、蛋白胨0.5%、大豆粉1.0%、葡萄糖0.1%、酵母膏0.07%、MnSO₄ 0.02%。培養條件接種量為2%~3%（v/v），培養方式為震蕩培養。在此條件下，芽孢數量可以達到3.5×10⁸ cfu/ml，優化后凝結芽孢桿菌產芽孢的能力都有了很大的提高。另一方面，本試驗初步研究了凝結芽孢桿菌液體發酵芽孢形成的條件，還有一些因素值得探討，比如培養溫度，pH值以及培養時間等；培養溫度過低會導致菌體生長緩慢，不利于芽孢形成；過高的溫度會使菌體發生自溶，也不利于芽孢形成，因而有待進一步研究。