發(fā)酵飼料對生長育肥豬結(jié)腸微生物發(fā)酵及菌群組成的影響
生長育肥豬的健康狀況直接影響到豬生產(chǎn)的經(jīng)濟效益。為改善豬體健康，傳統(tǒng)方法是在飼料中添加飼用抗生素來實現(xiàn)該目的，但隨著人們對飼用抗生素帶來的藥物殘留及生態(tài)安全等問題的認識的不斷深入，飼料中禁用飼用抗生素已是大勢所趨；發(fā)酵飼料作為一種綠色、環(huán)保的新型健康飼料，一定程度上可以減少飼用抗生素的使用，降低養(yǎng)殖成本，因而受到養(yǎng)殖界的廣泛關(guān)注。
豬后腸具有復(fù)雜的微生物菌群，這些微生物在維持動物機體健康、改善機體代謝及維持腸道穩(wěn)態(tài)等方面起著重要作用。研究表明，使用發(fā)酵飼料可以減少腸道致病菌的定植，改善腸道健康，然而，目前仍不清楚使用發(fā)酵飼料對豬腸道菌群組成的具體影響，為闡明這一問題，本試驗以復(fù)合菌發(fā)酵飼料飼喂生長育肥豬，利用高通量測序手段研究了育肥豬結(jié)腸黏膜及其內(nèi)容物中細菌菌群組成的變化，擬為生物發(fā)酵飼料在育肥豬中的合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。
1材料和方法
1.1試驗動物、試驗日糧與試驗設(shè)計
試驗于2017年4月–2017年5月進行，選用健康、日齡基本一致、體重約60 kg的杜×長×大三元雜交豬24頭，隨機分為2組，分別為基礎(chǔ)日糧組(對照組)、復(fù)合菌發(fā)酵飼料組(試驗組)，每組4個重復(fù)，每重復(fù)3頭豬。日糧配方及營養(yǎng)水平見表1。
復(fù)合菌發(fā)酵飼料的制作程序如下：采用南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院消化道微生物實驗室保存的唾液乳桿菌L79、枯草芽孢桿菌B1121和釀酒酵母菌S1145制備菌液，并按質(zhì)量比2：2：1進行混合（復(fù)合菌的總數(shù)量約為1×109 CFU/g），取對照組基礎(chǔ)日糧，按2 g/kg復(fù)合菌液添加于日糧中，調(diào)節(jié)飼料濕度為40%，混合均勻后分裝至單通閥發(fā)酵袋中，于37 °C發(fā)酵2天，飼喂前再與基礎(chǔ)日糧以1：4的比例混合，將混合飼料作為試驗組日糧。試驗期間，每日飼喂2次，自由采食，自動飲水。試驗期為30 d。
1.2 樣品采集與制備
于試驗正式開始后第30 天，每組每個重復(fù)隨機選擇一頭豬屠宰，屠宰后迅速取出整個消化道，分腸段進行結(jié)扎，結(jié)腸全部內(nèi)容物迅速混勻后，測定內(nèi)容物pH值，另取部分內(nèi)容物按1：1的質(zhì)量比與去離子水混合，5000 g下離心10 min后，一部分上清液凍存于-20 °C冰箱中用于乳酸濃度的測定，另一部分上清液中以5：1的比例加入25%（W/V）偏磷酸與巴豆酸混合液，混勻后凍存于-20 °C冰箱中用于揮發(fā)性脂肪酸濃度的測定；取部分樣品于-20 °C保存，用于細菌DNA提??；無菌剪刀剪取結(jié)腸中段，無菌冰磷酸緩沖液清洗干凈，采用無菌載玻片將黏膜和肌肉層分離開，刮取黏膜，樣品于-80 °C保存?zhèn)溆谩?/span>
1.3 結(jié)腸內(nèi)容物中pH、乳酸和揮發(fā)性脂肪酸的測定
采用固體pH計(HANNA，美國)測定結(jié)腸內(nèi)容物pH，乳酸含量采用南京建成生物工程研究所的乳酸測試盒測定。樣品解凍后，12000 g離心5 min，取0.3 μL上清液于GC-14B型氣相色譜儀(Shimadzu，日本)測定揮發(fā)性脂肪酸濃度。
1.4 結(jié)腸黏膜和內(nèi)容物中DNA提取及MiSeq測序
選用美國MoBio公司PowerSoil-htp 96 Well Soil DNA Isolation Kit試劑盒對結(jié)腸黏膜樣本的基因組DNA進行提?。徊捎肅TAB法提取結(jié)腸內(nèi)容物中DNA，取0.3 g解凍的結(jié)腸內(nèi)容物，加入2 mL磷酸緩沖液后渦旋混勻、12000′g離心，類似操作，清洗樣品2–3次。在所得沉淀中加入1 mL CTAB溶液，混勻后轉(zhuǎn)移至含有0.3 g滅菌鋯珠的鋯珠管中，采用珠磨儀(Biospec，美國)破碎細胞，再采用酚-氯仿-異戊醇提取結(jié)腸內(nèi)容物中細菌總DNA。采用NanoDrop ND-2000 spectrophotometer (Thermo fisher，美國)測取DNA濃度。在Illumina (MiSeq)平臺進行DNA雙端測序。使用細菌16S rRNA基因的V4區(qū)作為模板，進行PCR擴增，引物序列為515F (5′-barcode-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3)和806R (5′-GGACTACCVGGGTATCTAAT-3′)。擴增條件為：95 °C 2 min；95 °C 1 min，55 °C 1 min，72 °C 1 min，25個循環(huán)；72 °C 5 min。
1.5 生物信息學(xué)分析
根據(jù)Barcode的信息，將單個樣品數(shù)據(jù)拆分出來，刪除引物序列，進行測序序列質(zhì)量控制，將不含樣品信息的序列、過短或過長的序列、出現(xiàn)ambiguous堿基及含有過多homologous堿基的序列去除；通過質(zhì)量檢查的優(yōu)質(zhì)序列，應(yīng)用QIIME (v.1.8.0)軟件進行分析處理，應(yīng)用Ribosomal Database Project (RDP) Classifier 2.3進行分類，使用SILVA數(shù)據(jù)庫(v.1.1.9)進行序列比對(alignment)，確定每條序列的分類等級。OTUs (operational taxonomic units，分類操作單元)劃分以序列相似性97%為標準。
1.6 多樣性分析
通過豐富度指數(shù)(Chao、Ace)、多樣性指數(shù)(Shannon、Simpson)對樣品中物種Alpha多樣性進行分析；采用隨機抽樣的方法抽取OTU數(shù)據(jù)，以抽到的序列數(shù)與它們所能代表的OTU數(shù)目構(gòu)建曲線，即得稀疏曲線；基于OTU相對豐度對結(jié)腸黏膜及內(nèi)容物樣本中菌落組成進行門水平、屬水平分析。
1.7 統(tǒng)計分析
試驗所得數(shù)據(jù)經(jīng)Excel (2010)初步處理后，常規(guī)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件中的獨立樣本t檢驗方法進行分析，高通量測序結(jié)果采用Kruskal-Wallis進行非參數(shù)檢驗。顯著性水平(P值)置于0.05。
2生物發(fā)酵飼料的作用機理
2.1 結(jié)腸內(nèi)容物中發(fā)酵參數(shù)的測定
表2為育肥豬結(jié)腸內(nèi)容物中pH、乳酸及VFA濃度的測定，與對照組比較，采食20%復(fù)合菌發(fā)酵飼料的豬結(jié)腸內(nèi)容物中僅丁酸水平顯著升高(P<0.05)，而兩組間在pH、乳酸、乙酸、丙酸、異丁酸、戊酸、異戊酸和總揮發(fā)性脂肪酸含量方面無顯著差異(P>0.05)。
2.2 結(jié)腸黏膜及內(nèi)容物OTU水平分析
由圖1 可見，結(jié)腸黏膜(A)及內(nèi)容物(B)的稀疏曲線顯示，隨著測序深度增加，曲線逐漸趨于平緩，說明測序數(shù)據(jù)量合理。
2.3 結(jié)腸黏膜及內(nèi)容物細菌群落的多樣性分析
由表3可見，飼喂含發(fā)酵飼料的日糧對育肥豬結(jié)腸黏膜及內(nèi)容物中細菌的OTU數(shù)量、ACE及Chao等特種豐度和多樣性指數(shù)并沒有顯著影響(P>0.05)。由圖2可見，PCA圖顯示，對照組與處理組兩組間均可明顯區(qū)分開，說明兩組菌群之間存在差異性。進一步AMOVA分析，顯示飼喂復(fù)合菌發(fā)酵飼料顯著影響了育肥豬結(jié)腸黏膜(Fs=2.19，P=0.025)和內(nèi)容物(Fs=1.92，P=0.026)的細菌群落。
2.4 結(jié)腸黏膜及內(nèi)容物細菌類群分析
Venn圖可反映樣本間及組間共有和特有的OTU數(shù)目，從而直觀地反映出樣本間及組間細菌菌群組成的重疊情況。圖3-A中可以看出結(jié)腸黏膜中共有的細菌OTU數(shù)目為411個，代表物種分別屬于腸球菌屬(Enterococcus)、魏斯菌屬(Weissella)、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)等。其中，對照組獨有的細菌OTU分別屬于金黃桿菌屬(Chryseobacterium)、乳桿菌目(Lactobacillales)；發(fā)酵飼料組獨有的細菌OTU分別屬于芽孢桿菌科(Bacillaceae)、葡糖桿菌屬(Gluconobacter)、醋酸桿菌屬(Acetobacter)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、魏斯菌屬(Weissella)、綠膿桿菌屬(Pseudomonas)。
從圖3-B中可以看出，結(jié)腸內(nèi)容物中共有的OTU數(shù)目為405個，代表物種分別屬于腸球菌屬(Enterococcus)、魏斯菌屬(Weissella)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)等。其中，對照組育肥豬結(jié)腸內(nèi)容物中獨有的細菌OTU分別屬于黏膠球形菌門(Lentisphaerae)、擬桿菌目(Bacteroidales)、密螺旋體屬(Treponema)、厭氧螺菌屬(Anaerobiospirillum)、乳桿菌目(Lactobacillales)；發(fā)酵飼料組獨有的細菌OTU分別屬于芽孢桿菌科(Bacillaceae)、葡糖桿菌屬(Gluconobacter)、醋酸桿菌屬(Acetobacter)、擬桿菌目(Bacteroidales)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、魏斯菌屬(Weissella)。
2.5 結(jié)腸細菌門水平分析
由圖4可見，育肥豬結(jié)腸黏膜細菌菌群中有16 個菌門，其中優(yōu)勢菌門為厚壁菌門(46.13%)、變形菌門(31.55%)、擬桿菌門(10.94%)，在門豐度上，兩組之間未有顯著變化；在內(nèi)容物中的細菌菌群共檢測到15個菌門，其中優(yōu)勢菌門為厚壁菌門(52.32%)、變形菌門(37.52%)、擬桿菌門(3.25%)。與對照組比較，飼喂發(fā)酵飼料組的育肥豬結(jié)腸內(nèi)容物中螺旋體菌門的相對豐度顯著升高(P<0.05)，但對其他菌門的豐度無顯著影響(P>0.05)。
2.6 結(jié)腸細菌屬水平分析
育肥豬結(jié)腸黏膜(圖5-A)及內(nèi)容物(圖5-B)中細菌屬水平相對豐度如圖所示，育肥豬結(jié)腸內(nèi)容物中共檢測到116個菌屬，以相對豐度0.5%為標準篩選出35個優(yōu)勢菌屬，與對照組比較，發(fā)酵飼料組未分類菌屬、Subdoligranulum菌屬、脫硫弧菌屬和魏斯菌屬的相對豐度顯著升高(P<0.05)。黏膜中共檢測到116個菌屬，以相對豐度0.5%為標準篩選出34個優(yōu)勢菌屬，與對照組比較，發(fā)酵飼料組中的未分類菌屬、柔嫩梭菌屬和魏斯菌屬的相對豐度顯著升高(P<0.05)。
2.7 結(jié)腸細菌群落的功能預(yù)測
利用PICRUSt作為一種預(yù)測工具對結(jié)腸黏膜及內(nèi)容物中細菌功能進行預(yù)測，在所有樣品中，總共發(fā)現(xiàn)39個基因家族；通過對KEGG通路的PCA分析，顯示無論結(jié)腸黏膜還是內(nèi)容物，兩組樣品之間未區(qū)分開，表明兩組之間的功能存在一定的相似性(圖6)。這些基因家族中，大部分基因與膜轉(zhuǎn)運(對照組在黏膜中為11.92%，內(nèi)容物中為11.62%；試驗組分別為11.72%，11.78%)、碳水化合物代謝(對照組在黏膜和內(nèi)容物中分別為9.80%，10.13%；試驗組分別為9.85%，10.13%)、氨基酸代謝(對照組在黏膜和內(nèi)容物中分別為9.61%，9.72%；試驗組分別為9.63%，9.68%)相關(guān)。在所有基因家族中，結(jié)腸黏膜細菌中，涉及免疫系統(tǒng)(P=0.021)和翻譯(P=0.021)的基因家族的相對豐度顯著高于對照組，而有關(guān)復(fù)制和修復(fù)(P=0.043)、膜轉(zhuǎn)運(P=0.04)的基因家族相對豐度顯著低于對照組；在結(jié)腸內(nèi)容物細菌菌群中，飼喂發(fā)酵飼料組的細菌菌群中有關(guān)遺傳信息處理(P=0.021)的基因家族相對豐度顯著高于對照組，而有關(guān)免疫系統(tǒng)疾病(P=0.021)和神經(jīng)系統(tǒng)(P=0.043)的基因家族相對豐度顯著低于對照組。
3討 論
消化道微生態(tài)是豬機體最為重要和復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)之一，其中菌群的數(shù)量及種類可隨著機體的生長發(fā)育而不斷發(fā)生變化，維持一種復(fù)雜的動態(tài)平衡，在長期進化過程中，豬消化道微生態(tài)與宿主形成了互利共生的關(guān)系。豬微生物消化的主要場所位于消化道后段，胃和小腸未吸收的營養(yǎng)素進入后腸，經(jīng)微生物進一步發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)物可被吸收，進入機體起到供能及調(diào)控宿主代謝與免疫的作用。本實驗發(fā)現(xiàn)，飼喂含發(fā)酵飼料的日糧的豬結(jié)腸中丁酸含量顯著升高，由于丁酸是動物體內(nèi)腸上皮細胞組織再生和修復(fù)的主要營養(yǎng)物質(zhì)，其還可抑制腸道內(nèi)的病原菌或腐敗菌生長，促進益生菌的發(fā)育和增殖；此外，已有研究表明，丁酸還可通過多種途徑影響結(jié)腸屏障功能，改善結(jié)腸上皮細胞防御功能，緩解腸炎。因此，發(fā)酵飼料組豬結(jié)腸中丁酸含量升高，說明飼喂發(fā)酵飼料有利于豬后腸道健康。
本試驗在育肥豬結(jié)腸黏膜中檢測到16個菌門和116個菌屬，內(nèi)容物中共檢測到15個菌門和116個菌屬。在門水平上，本研究發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門和擬桿菌門是結(jié)腸黏膜及內(nèi)容物中相對豐度最高的兩個細菌門類，目前關(guān)于這類細菌的主要生理功能的研究顯示，這兩個菌門主要參與日糧中多糖物質(zhì)和蛋白質(zhì)降解。同時，有研究表明，厚壁菌門和擬桿菌門是腸道細菌中主要的菌門，因此，在豬結(jié)腸黏膜及內(nèi)容物中，厚壁菌門和擬桿菌門在結(jié)腸微生物發(fā)酵及微生態(tài)平衡中起著關(guān)鍵作用。在屬水平上，本研究發(fā)現(xiàn)，柔嫩梭菌是厚壁菌門的主要成員之一，前人研究表明，該類細菌菌群可利用底物中的纖維素發(fā)酵產(chǎn)生包含丁酸在內(nèi)的多種揮發(fā)性脂肪酸，Subdoligranulum菌屬是柔嫩梭菌屬的一個亞屬，其特性與柔嫩梭菌屬相似。本試驗中，試驗組育肥豬結(jié)腸黏膜中柔嫩梭菌屬和內(nèi)容物中Subdoligranulum菌屬相對豐度顯著升高，由于柔嫩梭菌屬和Subdoligranulum菌屬為丁酸產(chǎn)生菌，其相對豐度升高會導(dǎo)致結(jié)腸中丁酸水平上升，該結(jié)果也與發(fā)酵飼料組結(jié)腸內(nèi)容物中丁酸水平顯著升高相印證。
豬腸道黏膜菌群是一類主要定植在豬腸道黏膜上的微生物，這類微生物菌群可形成生物膜，起到微生物屏障作用。有研究顯示，宿主腸道內(nèi)微生物屏障可阻礙病原菌在腸壁上的定植，并可促進腸黏膜細胞增殖，增強機體的免疫機能。而一旦腸道菌群與宿主間的動態(tài)平衡被打破，致病菌可大量增殖，就有可能導(dǎo)致各類疾病的發(fā)生。魏斯菌屬是乳酸菌的一種，有研究表明，魏斯菌屬對多種革蘭氏陽性和陰性菌有抑制作用，魏斯菌屬可產(chǎn)生一種葡聚糖，促進有益菌如雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌的生長。本試驗中，試驗組育肥豬結(jié)腸內(nèi)容物中魏斯菌屬的相對豐度顯著升高，該結(jié)果說明，日糧中添加發(fā)酵飼料有利于改善豬結(jié)腸的菌群結(jié)構(gòu)。同時，本研究在發(fā)酵飼料組豬結(jié)腸中檢測到大量有益菌如葡糖桿菌和醋酸桿菌，而一些在對照組豬結(jié)腸中檢測到的致病菌如密螺旋體屬、產(chǎn)吲哚金黃桿菌等并未在發(fā)酵飼料豬結(jié)腸黏膜上檢測到；這些結(jié)果進一步說明，飼喂復(fù)合菌發(fā)酵飼料可增加育肥豬結(jié)腸黏膜上有益菌數(shù)量，抑制有害菌增殖。
相關(guān)研究表明，腸道細菌對維持機體代謝與健康起著重要作用，本試驗應(yīng)用PICRUSt軟件預(yù)測了育肥豬結(jié)腸黏膜和內(nèi)容物上附著細菌的潛在功能。結(jié)果顯示，飼喂發(fā)酵飼料組的育肥豬結(jié)腸黏膜及內(nèi)容物中細菌菌群的潛在功能與對照組之間皆存在顯著差異，說明細菌群落的改變可能會導(dǎo)致其功能的改變。與對照組比較，試驗組育肥豬結(jié)腸有關(guān)免疫系統(tǒng)的細菌基因豐度增多，而有關(guān)免疫系統(tǒng)疾病的細菌基因比例減少，結(jié)果說明，飼喂復(fù)合菌發(fā)酵飼料可改善育肥豬后腸健康；此外，試驗組育肥豬結(jié)腸中有關(guān)遺傳信息處理及翻譯的細菌基因的百分比升高，這說明飼喂復(fù)合菌發(fā)酵飼料后，腸道細菌可能對自身遺傳信息的表達能力增強，從而增強其活性。
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