生物方法降解黃曲霉毒素的研究
導(dǎo)讀
黃曲霉毒素(aflatoxin簡(jiǎn)稱AFT或AT)主要由基因同源的黃曲霉和寄生曲霉等真菌在一定的環(huán)境條件下發(fā)生的復(fù)雜酶促反應(yīng)生物合成的次級(jí)代謝產(chǎn)物。目前鑒定出的共有18種，分為B族和G族兩大類，在動(dòng)物體內(nèi)代謝可產(chǎn)生黃曲霉毒素M1、M2等多種同源衍生物。它給糧食及飼料造成嚴(yán)重污染，其中黃曲霉毒素B1是黃曲霉毒素中毒性最強(qiáng)的物質(zhì)。黃曲霉毒素主要作用于肝臟，引起肝臟病變。食用了含黃曲霉毒素的食物，可引起人畜急性中毒從而引發(fā)疾病，且黃曲霉毒素有強(qiáng)致癌、導(dǎo)致基因突變和畸形作用，嚴(yán)重威脅動(dòng)物及人類健康，如何除去糧食及飼料中的黃曲霉毒素被人們廣泛關(guān)注。
1黃曲霉毒素常規(guī)脫毒方法
1.1 物理化學(xué)方法脫毒
黃曲霉毒素常規(guī)脫毒方法有物理方法和化學(xué)方法。物理學(xué)方法包括霉變部分篩選剔除法、射線輻射降解法、高溫加熱處理法、溶劑萃取法，這些方法對(duì)除去黃曲霉毒素有一定效果。在實(shí)際操作中，篩選剔除法過程繁瑣，射線輻射法對(duì)不同樣品的處理效果存在很大差異，高溫加熱會(huì)破壞飼料中的營(yíng)養(yǎng)成分，同時(shí)射線輻射和高溫處理將會(huì)產(chǎn)生大量能源消耗，有機(jī)溶劑萃取產(chǎn)生的廢物無(wú)法很好的處理。從而這些方法都很難在大規(guī)模批量生產(chǎn)中應(yīng)用。
化學(xué)處理方法是用化學(xué)試劑破壞黃曲霉毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其中內(nèi)酯環(huán)存在于黃曲霉毒素的一般結(jié)構(gòu)式中，只有內(nèi)酯環(huán)被打開時(shí)，熒光才會(huì)消失，毒性才會(huì)消除?；瘜W(xué)處理方法包括氨化、堿化和臭氧等處理方法，其中氨化和堿化處理是通過化學(xué)作用使黃曲霉毒素內(nèi)酯環(huán)破壞，生成相應(yīng)的香豆素銨鹽或者鈉鹽，從而消除黃曲霉毒素的毒性；臭氧的氧化功能打開黃曲霉毒素內(nèi)酯環(huán)，消除黃曲霉毒素的毒害。但這些方法雖然對(duì)去除黃曲霉毒素有一定效果，但在脫毒時(shí)，會(huì)產(chǎn)生有毒有害化學(xué)成分殘留，破壞飼料產(chǎn)品品質(zhì)，且臭氧處理成本高，不易操作，此方法同樣很難應(yīng)用在規(guī)?；a(chǎn)中。
1.2 吸附方法脫毒
在工業(yè)生產(chǎn)中，一種是以添加蒙脫石、沸石、膨潤(rùn)土等硅酸鹽吸附劑以及納米吸附劑的物理吸附來去除霉菌毒素，其吸附原理是硅酸鹽吸附劑強(qiáng)大的表面積與靜電作用，與帶有離子極性的霉菌毒素結(jié)合。其中硅酸鹽吸附劑對(duì)黃曲霉毒素有很好的吸附能力，劉媛婷等通過體外實(shí)驗(yàn)表明水合鋁硅酸鹽對(duì)黃曲霉毒素的吸附率可達(dá)到99%，且吸附劑能夠明顯減輕黃曲霉毒素對(duì)動(dòng)物的毒害作用。史瑩華等通過豬日糧中添加蒙脫石吸附劑，顯著降低了黃曲霉毒素對(duì)動(dòng)物肝臟的毒害作用。但硅酸鹽吸附方法在吸附毒素的同時(shí)會(huì)吸附氨基酸、維生素等營(yíng)養(yǎng)成分，使飼料中的營(yíng)養(yǎng)成分含量降低，其中存在著動(dòng)物體內(nèi)代謝過程重新被暴露的風(fēng)險(xiǎn)。此方法有待于進(jìn)一步優(yōu)化，明確吸附劑在動(dòng)物體內(nèi)的代謝過程，減少吸附劑對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸附。
另一種吸附方法是利用微生物對(duì)黃曲霉毒素吸附，研究較多的是酵母菌和乳酸菌的吸附作用，常見的有釀酒酵母、鼠李糖乳酸桿菌、干酪乳桿菌等。酵母菌的細(xì)胞壁電鏡下為“三明治”結(jié)構(gòu)口 ，其細(xì)胞壁的特殊結(jié)構(gòu)和成分形成的分子作用力吸附黃曲霉毒素，Hernandezmendoza等利用緩沖液重復(fù)洗滌來評(píng)價(jià)釀酒酵母一黃曲霉毒素復(fù)合物的穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明釀酒酵母能穩(wěn)定的與黃曲霉毒素結(jié)合，防止黃曲霉毒素被胃腸道吸收；Shah等發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素B1與乳酸茵形成黃曲霉毒素B1-乳酸菌復(fù)合物來吸附黃曲霉毒素。Redzwan等通過建立體外動(dòng)物模型和人類臨床試驗(yàn)，表明益生菌添加劑可以減少黃曲霉毒素在人類膳食和動(dòng)物飼料中的暴露，降低和緩解黃曲霉毒素在人體和動(dòng)物體內(nèi)的毒害作用，最終被應(yīng)用于飼料工業(yè)。但微生物的吸附作用為物理吸附，是一個(gè)可逆的過程，毒素不能完全被吸附，也存在著在動(dòng)物體內(nèi)毒素被釋放的風(fēng)險(xiǎn)，單一的微生物吸附對(duì)黃曲霉毒素的解毒作用存在一定的局限性。
2生物學(xué)方法降解黃曲霉毒素
生物學(xué)方法降解黃曲霉毒素，是近年來研究熱門的一種脫毒方法，主要為微生物的降解，包括真菌和細(xì)菌兩大類。在黃曲霉毒素生物方法降解的研究中，大量的利用篩選得到能夠降解黃曲霉毒素的生物菌種，通過自身代謝產(chǎn)生某種胞內(nèi)酶或者胞外酶將黃曲霉毒素分子的毒性基團(tuán)降解為無(wú)毒害的物質(zhì)被生物利用或通過代謝排出體外。另一方面通過生物酶的單一活性成分對(duì)黃曲霉毒素進(jìn)行降解為無(wú)毒的其他組分，但生物酶的來源、活性以及穩(wěn)定性需要優(yōu)化與提高。
2.1 真菌對(duì)黃曲霉毒素的降解作用
降解黃曲霉毒素的真菌，包括寄生曲霉菌、根霉菌、白腐真菌、假密環(huán)菌和黑曲霉等 引。國(guó)外對(duì)真菌的研究較早，Doyle等通過發(fā)酵發(fā)現(xiàn)寄生曲霉在生長(zhǎng)14 h后，菌絲產(chǎn)生一種乳過氧化物酶將黃曲霉毒素B1降解，其產(chǎn)物為黃曲霉毒素B2a的衍生物和另一種水溶性衍生物，降解產(chǎn)物的毒性遠(yuǎn)低于黃曲霉毒素B1。Cole等通過同位素標(biāo)記法研究表明根霉菌能夠?qū)ⅫS曲霉毒素降解為兩個(gè)具有熒光的羥基化合物。Motomura等從一種平菇中分離出降解黃曲霉毒素的酶，通過熒光含量的測(cè)定，表明這種酶能夠降解黃曲霉毒素的內(nèi)酯環(huán)，并通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)得到其蛋白分子量大小大概為90 ku。
國(guó)內(nèi)對(duì)黃曲霉毒素的真菌降解研究中，李冰等研究黑曲霉發(fā)酵對(duì)黃曲霉毒素B1的降解效果，在一定件條下黃曲霉毒素B1的降解率達(dá)到93.28%，在對(duì)其胞外粗提液、活細(xì)胞、細(xì)胞提取物降黃曲霉毒素進(jìn)行分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)其中黑曲霉的胞外粗提液對(duì)黃曲霉毒素的降解率最高，表明黃曲霉毒素B1的降解可能是黑曲霉分泌的一種酶的化學(xué)作用。徐丹等通過研究黑曲霉對(duì)黃曲霉生長(zhǎng)、產(chǎn)毒以及對(duì)黃曲霉毒素的影響，驗(yàn)證了黑曲霉既能抑制黃曲霉生長(zhǎng)、產(chǎn)毒，又能夠降解黃曲霉毒素。
劉大嶺等發(fā)現(xiàn)食用型真菌假密環(huán)菌能夠降解黃曲霉毒素，其活性物質(zhì)為一種胞內(nèi)的氧化酶，提取的粗酶液能夠高效降解黃曲霉毒素，降解效率達(dá)到80%；隨后從提取物中分離出能降解黃曲霉毒素毒性的解毒酶，通過SDS-PAGE測(cè)定活性蛋白大小表觀分子量為51.8 ku；進(jìn)一步構(gòu)建互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)文庫(kù)并建立原核克隆及表達(dá)載體，得到重組黃曲霉毒素解毒酶活性蛋白(ADTZ)，基因大小為2 088 bp，編碼695個(gè)氨基酸，并成功的將黃曲霉毒素解毒酶基因在畢赤酵母中表達(dá)；對(duì)黃曲霉毒素解毒酶三維結(jié)構(gòu)外層部位的關(guān)鍵氨基酸殘基進(jìn)行了改造，獲得了一種對(duì)胰蛋白酶抗性提高的重組黃曲霉毒素氧化酶(AFO)，其基因片段大小為2 321 bp，對(duì)胰蛋白酶的抗性比黃曲霉毒素解毒酶(ADTZ)提高2.73倍，半衰期延長(zhǎng)了72min，其他酶學(xué)性質(zhì)與野生型酶基本一致。
以上研究表明，真菌微生物降解黃曲霉毒素的機(jī)理是一個(gè)復(fù)雜過程，易受環(huán)境和自身因素影響，可控性、穩(wěn)定性差，降解產(chǎn)物不明確，但真菌中的單一活性成分對(duì)黃曲霉毒素有很好的降解效果。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)黃曲霉的研究更多的是黃曲霉毒素產(chǎn)生和降解機(jī)理的研究。
2.2 細(xì)菌對(duì)黃曲霉毒素的降解作用
國(guó)內(nèi)外對(duì)細(xì)菌生物降解黃曲霉毒素有大量的報(bào)道，研究表明許多細(xì)菌微生物具有一定的降解黃曲霉毒素的能力。國(guó)外的研究中，Lilleho等1966年通過篩選酵母菌、霉菌、細(xì)菌、放線菌、藻類和真菌孢子降解黃曲霉毒素的能力，最終篩選出橙色黃桿菌能夠降解黃曲霉毒素B1，Doyle等證明這種物質(zhì)為一種乳過氧化物酶。Smiley等進(jìn)一步報(bào)道橙色黃桿菌的粗蛋白質(zhì)提取物在水溶液中降解黃曲霉毒素B1的降解率能夠達(dá)到74.5%；分別用熱處理、脫氧核糖核酸酶I處理、蛋白酶K處理初蛋白質(zhì)提取物，降解率分別為5.5 %、80.5% 、34.5%，進(jìn)一步驗(yàn)證這種對(duì)黃曲霉毒素的降解機(jī)理可能是酶促反應(yīng)。Cserhati等篩選出32株紅球菌菌株能夠降解黃曲霉毒素，利用發(fā)酵培養(yǎng)、酶聯(lián)免疫吸附法(EUSA)檢測(cè)，結(jié)果有16株菌株對(duì)黃曲霉毒素的降解效率達(dá)到100%，4株菌株的降解效率達(dá)到98%。
國(guó)內(nèi)對(duì)黃曲霉毒素的細(xì)菌降解研究中，李俊霞等利用香豆素，從動(dòng)物糞便、發(fā)霉糧食、實(shí)驗(yàn)室原有菌株等1 500種微生物細(xì)菌和芽孢桿菌樣品中篩選出能夠降解黃曲霉毒素的菌株，并用黃曲霉毒素B1作為培養(yǎng)基底物進(jìn)行復(fù)篩，共得到來自腸道的8株菌株和來自發(fā)霉飼料的2株菌株能夠降解黃曲霉毒素，其中從貘糞便中獲得的假單胞菌屬嗜麥芽窄食單胞菌對(duì)黃曲霉毒素的降解效果最好。關(guān)舒等對(duì)嗜麥芽窄食單胞菌培養(yǎng)基胞外粗提液、活細(xì)胞和細(xì)胞提取物分別進(jìn)行降解黃曲霉毒素處理，37℃下孵育72 h后檢測(cè)胞外提取物中黃曲霉毒素B1減少了82.5%，而活細(xì)胞提取物對(duì)黃曲霉毒素的降解效率非常低，用蛋白酶K，蛋白酶K加十二烷基硫酸鈉(SDS)和加熱處理培養(yǎng)物上清液能顯著降低或根除培養(yǎng)物上清液的降解活性。證明其中的嗜麥芽窄食單胞菌對(duì)黃曲霉毒素的降解為生物酶的降解。
雷元培等對(duì)枯草芽孢桿菌進(jìn)行降解黃曲霉毒素解毒的生物活性、抗菌性及抗逆性的研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵后的上清液中存在解毒活性組分，對(duì)解毒活性物質(zhì)進(jìn)行加熱和蛋白酶K變性處理后，解毒活性顯著降低，表明起解毒作用的活性物質(zhì)是其分泌的一種胞外酶，同時(shí)所分泌的活性蛋白具有強(qiáng)解毒活性，特異性和作用效果溫和的特點(diǎn)，不會(huì)破壞飼料中的營(yíng)養(yǎng)成分，適用于除去飼料中的黃曲霉毒素。
3前景展望
目前，生物防治黃曲霉毒素研究取得了一定的進(jìn)展，但國(guó)內(nèi)外使用生物學(xué)方法降解黃曲霉毒素在飼料工業(yè)中的應(yīng)用剛剛起步。黃曲霉毒素雖能被不同的菌株所降解，但目前的防治方法依然還存在著許多問題，一般研究主要側(cè)重于降解黃曲霉毒素菌株的篩選，但對(duì)于降解的機(jī)理及解毒酶特性需要進(jìn)一步研究。黃曲霉毒素分解酶相關(guān)的基因報(bào)道還比較少，且酶的產(chǎn)量和活性不太高，毒素不能被完全降解。因此，需要用到生物化學(xué)、分子生物學(xué)、基因工程的手段對(duì)微生物菌種進(jìn)行篩選及改造，并獲得黃曲霉毒素分解酶的組成基因并進(jìn)行高效表達(dá)，開發(fā)出能夠高效降解黃曲霉毒素的生物菌種。將生物發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用于飼料工業(yè)，以減少飼料的污染和浪費(fèi)，降低養(yǎng)殖行業(yè)和飼料行業(yè)經(jīng)濟(jì)成本。
注：本文由生物飼料開發(fā)國(guó)家工程研究中心（BFC）小編整理發(fā)布，如有任何建議或意見及投稿等，請(qǐng)您加小編微信（13260429991）交流互動(dòng)。
參考文獻(xiàn)略
