1.5測定指標及方法 　

用于測定纖維含量的樣品粉碎過0.84 mm篩，用于測定CP和TCA-SP含量的樣品粉碎過0.42mm篩，用于測定氨基酸和GLS含量的樣品粉碎過0.25mm篩。對工藝優化用菜籽餅發酵前后的pH及CP、TCA-SP、NDF、ADF、GLS和氨基酸含量進行測定，以及菜籽餅發酵前后掃描電鏡分析和蛋白質分子質量分析。 對9個不同來源菜籽餅粕發酵前后的pH及 CP、TCA-SP、NDF、ADF和GLS含量進行測定。

1.5.1養分測定  GLS含量采用氯化鈀比色法測定，DM含量通過105℃烘箱干燥 4h測定，CP含量采用凱氏定氮法測定，TCA-SP含量參照NY/T3801-2020 測定，NDF含量 參照GB/T 20806-2006采用Van Soest分析法測定，ADF含量參照 NY/T 1459-2007采用Van Soest分析法測定，氨基酸含量利用氨基酸自動分析儀測定。

1.5.2 pH測定 　 　

稱取發酵前后的樣品5.0g，加蒸餾水50ml， 攪拌30min后，用預先校正過的pH計測定其pH。

1.5.3電鏡掃描分析 　 　

取適量樣品粉碎過0.25mm篩后，置于導電膠固定在掃描電鏡專用樣品臺上，用磁控濺射鉑金進行噴金處理，再將處理好的樣品用掃描電鏡（SU3500，日本）進行觀察并拍照留存。

1.5.4蛋白質分子質量分析 　 　

將樣品碎過0.25mm，取適量樣品采用變性結合加熱的方法來提取菜籽餅粕蛋白質并進行十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析，具體操作參照文獻進行。

1.6數據統計與分析 　 　

采用Excel2010軟件對數據進行初步處理， 采用SAS9.4軟件對數據進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Duncan氏法進行多重比較，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標準。

2.2　酶菌協同發酵菜籽餅的正交試驗結果

由表３可知，從極差結果來看，果膠酶對總變化率的影響最大，纖維素酶次之，α－半乳糖苷酶的影響最小，即果膠酶＞纖維素酶＞α－半乳糖苷酶，最優配比組合為纖維素酶∶果膠酶∶α－半乳糖苷酶＝3:3:3，此時總變化率為46.44%。

2.3　酶菌協同發酵對菜籽餅ｐＨ及化學成分的影響

由表４可知，在最優配比組合酶菌協同發酵條件下，菜籽餅發酵后的pH顯著低于發酵前（P＜0.05），CP、TCA-SP含量顯著高于發酵前（P＜0.05），NDF、ADF、半纖維素、GLS含量顯著低于發酵前（P＜0.05），谷氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸及總氨基酸含量顯著高于發酵前（P＜0.05）。

2.4　酶菌協同發酵對菜籽餅表面形態的影響

在最優配比組合酶菌協同發酵條件下，電鏡觀察發酵前后菜籽餅表面形態見圖1。在400倍電鏡觀察下，發酵前的菜籽餅顆粒大，形態不規則；發酵后的菜籽餅顆粒較小，結構較松散。在3000倍電鏡觀察下，發酵前的菜籽餅表面光滑平整，呈較大的片狀，無小孔隙且結構較為完整；發酵后的菜籽餅表面粗糙，呈現不規則分布，孔隙較多。

2.5　酶菌協同發酵對菜籽餅蛋白質分子質量的影響

在最優配比組合酶菌協同發酵條件下，發酵前后菜籽餅的蛋白質分子質量結果見圖2。A區域蛋白質分子質量為30～75 ku，B區域蛋白質分子質量為12～23 ku，發酵前菜籽餅的蛋白質在Ａ區域分布有多個條帶，發酵后菜籽餅的蛋白質主要分布在Ｂ區域。 

2.6酶菌協同發酵對不同來源菜籽餅粕養分含量的影響

在最優配比組合酶菌協同發酵條件下，對９個不同來源菜籽餅粕進行酶菌協同發酵。

2.6..1　pH及CP、TCA-SP含量

由表５可知，發酵前，9個菜籽餅粕的pH在5.46～5.95，平均值為5.75；發酵后，９個菜籽餅粕的pH在3.92～4.27，平均值為4.06。9個菜籽餅粕發酵后的pH均顯著低于發酵前（P＜0.05），其中變化幅度最高的為菜籽餅9，降低幅度為1.98。

由表6可知，發酵前，9個菜籽餅粕的CP含量在37.07%～45.56%，平均值為43.00%;發酵后，９個菜籽餅粕的CP含量在38.85%～46.15%，平均值為43.57%。菜籽粕1、3及菜籽餅9發酵后的CP含量顯著高于發酵前（P＜0.05）。發酵前，9個菜籽餅粕的TCA-SP含量在2.11%～3.19%，平均值為2.42%；發酵后，9個菜籽餅粕的TCA-SP含量在5.35%～6.52%，平均值為5.95%。9個菜籽餅粕發酵后的TCA-SP含量顯著高于發酵前（p＜0.05），其中變化幅度最高的為菜籽粕1，提高幅度為192.38%。 

2.6.2　NDF和GLS含量

由表7可知，發酵前，9個菜籽餅粕的NDF含量在27.03%～40.39%，平均值為32.61%；發酵后，9個菜籽餅粕的NDF含量在20.62%～34.76%，平均值為26.08%。9個菜籽餅粕發酵后的NDF含量顯著低于發酵（P＜0.05），其中變化幅度最高的為菜籽粕7，降低了26.00%；變化幅度最低的是菜籽餅，降低了13.95%。

由表8可知，發酵前，9個菜籽餅粕的GLS含量在18.10～57.64 μmol/g，平均值為29.99μmol/g；發酵后,9個菜籽餅粕的GLS含量在13.62～46.23μmol/g，平均值為22.80 μmol/g。9個菜籽餅粕發酵后的GLS含量顯著低于發酵前（P＜0.05），其中變化幅度最高的為菜籽粕１，降低了31.30%；變化幅度最低的是菜籽粕４，降低了16.20%。

3.2　酶菌協同發酵對菜籽餅表面結構和蛋白質分子質量的影響

掃描電鏡結果表明，發酵前菜籽餅顆粒大形態不規則，經酶菌協同發酵后，顆粒變小，表面粗糙出現凹凸不平的孔狀。這與利用黑曲霉發酵菜籽粕的結果一致。菜籽餅完整細胞壁上的纖維網狀結構會保護其他養分如蛋白質和多糖免于被降解或轉化，當對菜籽餅進行堆肥發酵后，其纖維素網狀結構大部分被破壞。本試驗結果顯示，酶菌協同發酵后菜籽餅表面結構被破壞，使得表面積增加，在畜禽采食后，增加了腸道消化酶接觸飼料的面積，更有利于消化飼料。

菜籽蛋白主要有2種類別，主要是大分子的12S球蛋白（α亞基和β亞基）和小分子的2S白蛋白，其中12S球蛋白的分子質量在30～60 ku，2S白蛋白分子質量約為6、12和21 ku。本試驗結果顯示，未發酵菜籽餅主要為30～75 ku的大分子蛋白質，而酶菌協同發酵增加了小分子肽（＜15 ku）的分布，這表明酶菌協同發酵在一定程度上將大分子蛋白質分解為小分子肽，進而增加菜籽餅小肽含量，這與研究結果相似。與大分子蛋白質相比，小分子肽更易被家禽腸道所捕獲吸收，有利于提高飼料養分消化率。

3.3　酶菌協同發酵對不同來源菜籽餅粕養分含量的影響

與豆粕相比，菜籽餅粕的纖維含量較高，含有抗營養因子，極大限制了菜籽餅粕在畜禽中的應用。而不同菜籽餅粕的營養價值與養分消化率因來源不同、榨油工藝不同而有差異。油菜籽加工副產物可根據加工方式的不同分為高溫熱榨菜籽餅、低溫冷榨菜籽餅以及壓餅后浸提的菜籽粕，不同榨油過程中的溫度處理生產的菜籽餅粕的養分和抗營養因子含量均有所不同。研究發現，菜籽粕NDF含量與肉雞代謝能之間存在極顯著的負相關關系。研究發現，豬的標準回腸氨基酸消化率隨著菜籽粕中NDF等纖維含量的升高而顯著降低。因此，提高菜籽餅粕的可消化蛋白質含量，降低GLS及纖維含量，是提高菜籽餅粕營養價值的重要手段。

本試驗通過酶菌協同發酵，發現對9個不同來源的菜籽餅粕養分含量均有一定的改善作用。經過酶菌協同發酵后，菜籽餅粕的pH均顯著降低。pH的降低可提高畜禽腸道內胃蛋白酶的活性，從而促進對養分的消化吸收。經過酶菌協同發酵后，9個菜籽餅粕的CP含量略有升高，提高的幅度非常有限，在1%左右，說明本試驗酶菌協同發酵改善菜籽餅粕的營養價值，對CP含量的提高并不明顯，而發酵體系蛋白質含量的變化可能與菌體蛋白的產生有關。菌體蛋白產生量與發酵菌種有關，利用乳酸菌和地衣芽孢桿菌發酵菜籽粕，CP含量提高了12.09%；Shi等用黑曲霉發酵菜籽粕后，CP含量提高了16.90%。本試驗采用的枯草芽孢桿菌具有分泌酸性蛋白酶的活性，可促進飼料大分子蛋白質的進一步降解，這與蛋白質分子質量的結果相一致的。本試驗測定的9個菜籽餅粕的TCA-SP含量均有大幅度的提高，表明酶菌協同發酵對TCA-SP含量有明顯的提高作用。如前所述，TCA-SP主要是由氨基酸殘基組成的寡肽，動物吸收寡肽的能力要高于游離的氨基酸。研究發現，菜籽粕經蛋白酶酶解及黑曲霉發酵后TCA-SP含量增加了629.66%。本試驗結果與上述結果相似。

菜籽餅粕的纖維含量高于豆粕3倍以上，且飼料原料纖維含量與代謝能存在負相關。與飼喂玉米－豆粕基礎飼糧相比，飼喂菜籽餅粕原料的肉雞代謝能呈線性下降。相對較低的代謝能是限制菜籽餅粕在肉雞中飼喂效果的主要因素，這通常與纖維含量高有關。本試驗中，經過酶菌協同發酵后，9個菜籽餅粕的NDF含量均顯著降低，表明本試驗選用混合微生物并聯合使用適宜的非淀粉多糖酶，均有一定降解9個不同來源菜籽餅粕NDF的效果。植物源性細胞壁結構錯綜復雜，纖維互相纏繞形成堅固的網狀結構，而菜籽餅粕纖維主要是難以被家禽利用的結構性多糖，這種纖維網狀結構會將蛋白質及淀粉等可消化養分進行包裹，不容易被分解利用。而非淀粉多糖酶結合微生物進行酶菌協同發酵可對菜籽餅粕中纖維等抗營養因子或大分子結構更具針對性和特異性，這種策略延長了酶與底物的接觸與作用時間，能同時提高微生物發酵效果和酶解的效率。有研究表明，細胞壁的纖維網狀結構在纖維素酶、果膠酶的相互作用下得以打開并降解，此時微生物進入細胞內部發揮作用，將大分子化合物轉變為小肽等小分子化合物，并利用纖維降解產生的可溶性糖轉化為乳酸等代謝產物。朱曉峰等報道了在纖維素酶及果膠酶的酶解作用下，菜籽粕的NDF含量由38.12%降至18.68%；王衛衛研究發現，用甘露聚糖、α－半乳糖苷酶協同植物乳桿菌和酵母菌發酵可顯著降低棕櫚仁粕的NDF含量，本試驗結果與上述研究結果相似。

菜籽餅粕中的GLS可在芥子酶作用下分解為硫氰酸酯、異硫氰酸酯、噁唑烷硫酮及氰類化合物，可引起甲狀腺腫，導致生長遲緩，故降低了畜禽生長性能。本試驗中，經過酶菌協同發酵后，9個菜籽餅粕的GLS量顯著降低。降低菜籽餅粕中抗營養因子GLS的含量，是雙低菜籽餅粕育種技術的目標，也是采用發酵技術改善菜籽餅粕營養價值的主要目標之一，如利用枯草芽孢桿菌與毛菌混合發酵降解GLS，利用乳酸菌、酵母菌、地衣芽孢桿菌混合發降解GLS。GLS含量的降低緩解了其對畜禽腸道、肝臟及甲狀腺的損傷，進而提高畜禽對養分的消化吸收能力。此外，GLS含量的高低與生物發酵菌種有關，本試驗結果表明選用酶菌協同發酵不同來源的菜籽餅粕，均可以起到降解GLS的效果。

實戰操作技術——棉菜籽餅脫毒變身優質飼料替代豆粕操作新技術

當前豆粕價格很高有些地方貨源緊缺，而棉菜籽餅（棉籽粕、菜籽粕）價格相對便宜，棉菜籽餅是棉子、油菜籽榨油后剩下的餅狀殘渣，蛋白質含量較高，含有各種氨基酸成分。但由于棉菜籽餅中含有植酸、芥子堿等物質，這些物質含有一定的毒性，還會影響動物的消化吸收，不能大量使用，因此不建議直接飼喂給動物！

現在通過微生物飼料發酵劑的除毒脫毒技術，可以成功將菜籽餅變為優質添加飼料，直接按照1公斤發酵的棉菜籽餅（發酵前的重量）代替約0.85公斤豆粕進行使用。飼料發酵劑中的有益微生物，在發酵過程中分泌的代謝產物，可將棉菜籽餅中的毒性物質等有效分解。

豆粕、菜粕、棉粕成分對比

1.豆粕是一種高蛋白原料，無需脫毒即可用作飼料。其中蛋白質含量為40%-48%，賴氨酸含量為2.5%-3.0%，色氨酸含量為0.6%-0.7%，蛋氨酸含量為0.5%-0.7%。2020年11月12日報價每噸在3500元左右。

2.菜粕的粗蛋白含量在34%-38%之間，特點是蛋氨酸含量高（僅次于芝麻餅、粕），賴氨酸含量亦高。而精氨酸含量低，是餅、粕飼料中含量最低的。菜籽粕的有效能值偏低（淀粉含量低、菜籽殼難以消化利用）。礦物質中，鈣和磷的含量均高，硒和錳的含量亦高。特別是硒的含量是常用植物飼料中最高的。2020年11月12日報價每噸在2900元左右。

3.棉粕蛋白質含量一般為44.32%，僅次于豆粕的蛋白質含量48%，而高于菜籽粕的蛋白質含量36.04%。精氨酸含量高達3.6%-3.8%，而賴氨酸含量僅有1.3%-l.5%，只有豆粕的一半。2020年11月12日報價每噸在3000元左右。

是否需要脫毒處理

1.豆粕無需經過脫毒即可用作飼料。而且豆粕中富含蛋白質和多種氨基酸，在不需要額外加入動物性蛋白的情況下，僅豆粕中含有的蛋白質和氨基酸足以平衡家禽和豬的食譜，促進它們的營養吸收。只有當其他粕類單位蛋白成本遠低于豆粕時，豆粕才有可能被替代。

2.菜粕菜籽中含有硫葡萄糖苷、芥酸、單寧、皂角苷等不良成分，其中主要是硫葡萄糖苷。硫葡萄糖苷本身無毒，但在一定溫度和水分條件下，經過菜籽本身含有的芥子酶的酶解作用而產生異硫氰酸酯、唑烷硫酮和腈類等有害物質。這些物質可引起甲狀腺腫大，從而造成動物生長速度下降，繁殖力減退。單寧則妨礙蛋白質的消化，降低適口性。而芥酸阻撓脂肪代謝，造成心臟脂肪蓄積及生長受到抑制。。使用前需進行一定的脫毒處理，并且使用時要加以限制，具體喂量應根據菜粕中有害成分含量而定。經過脫毒處理的菜籽粕喂量可以加大，而“雙低”油菜籽生產的菜粕喂量要受限制。同時，應結合菜粕的氨基酸組成特點，適當搭配其它餅粕。

3.棉籽中含有對動物有害的棉酚及環丙烯脂肪酸，尤其是棉酚的危害很大。在制油過程中，由于蒸炒，壓榨等熱作用，大部分棉酚與蛋白質、氨基酸結合而變成結合棉酚，結合棉酚在動物消化道內不被動物吸收，故毒性很小。另一部分棉酚則以游離形式存在于餅、粕及油品中，這部分游離棉酚對動物毒性較大，尤其單胃動物過量攝取或攝取時間較長，可導致生長遲緩、繁殖性能及生產性能下降，甚至導致死亡。幼小動物對棉酚的耐受能力更低。由于棉籽餅、粕中游離棉酚對動物有害，因此，在使用棉餅、粕時，要根據飼喂對象及餅粕中游離棉酚的含量加以限量。反芻家畜在有優質粗料及多汁青料的情況下，棉籽餅、粕的用量不受限制，不會造成中毒。對單胃動物要限制喂量，最好使用經過脫毒處理的棉籽餅粕。同時，使用棉籽餅、粕配制飼糧要注意氨基酸平衡，尤其是棉籽餅、粕的賴氨酸含量低，且利用率差，應注意添加賴氨酸。

發酵操作技術

發酵棉菜籽餅其實也是一個脫毒技術，具體操作如下：

1.仔細檢查棉菜籽餅，剔除棉菜籽餅中嚴重變質發霉的部分，輕度發霉的原料可以忽略，因為微生物發酵能夠脫霉。

2.將棉菜籽餅粉碎并添加適量的玉米粉淀粉類的能量飼料等，調節飼料營養比例。

3.每噸棉菜籽餅加入2公斤食鹽、玉米粉（其它淀粉、面粉次粉等也可以，或者粉碎的生紅薯300公斤也可以）100公斤、“99多功能飼料發酵劑”1包（500g/包，市場售價約25元，以高濃度乳酸菌、酵母菌、復合酶制劑的專業發酵劑）。

4.在混合物料中添加適量水分，使混合物料含水量保持在55%左右，以“手抓一把并緊握，無水滴落，松手后輕觸即散”為宜，一般上述配方中需要加入清水約500-600公斤。

5.發酵方式根據實際環境條件各異，在桶、缸、塑料袋等容器中發酵均可。

6.發酵時要盡可能排盡空氣進行密封發酵。如果使用的發酵容器有密封不嚴實的隱患，要在一開始就在其外層包裹一層塑料袋并扎緊。發酵過程中不能啟封。

7.發酵時間受環境溫度影響，通常夏季發酵2-3天，冬季發酵5-7天即可完成。發酵完成后，有較為強烈的酸香味，ph值在3-4。

規模運用混合發酵現場

塑料缸、飼料袋（有內膜）均可做發酵飼料

采用池子發酵

發酵完成的棉菜粕飼喂動物技術

需要注意的是，發酵后的飼料酸度較低，不可以取代禽畜全部日糧。其他類發酵飼料同理。飼喂時根據不同情況，將發酵飼料按照一定比例添加到日糧中，發酵完成的棉菜粕為濕料，具體使用量每大概1.5-2公斤發酵棉菜粕（濕料）代替動物日糧配方中1公斤豆粕的使用量進行代替使用，與其它飼料混合后直接飼喂，由于棉菜籽粕蛋白較高，最高使用量不要超過禽畜日糧飼喂量的40%（濕料重量）。如果發現發酵飼料過酸適口性變差，可在飼喂前在陽光下曬1-2小時，或添加適量的碳酸氫鈉（小蘇打）即可改善。

發酵過程中與發酵后使用過程中，發酵的容器要一直保持密封狀態，可以長時間保存（一年左右）。

當前養殖業成本高居不下，而飼料成本是其中最高的，利用廉價原料發酵飼料（包括一些輕度發霉的粕類低價收回）是極佳解決辦法。通過微生物飼料發酵劑的發酵作用，可以將輕度霉變飼料變成優質飼料，將不易消化的物質分解為可被畜禽吸收的小分子糖類、氨基酸等。同時發酵飼料中富含有益微生物、酶制劑、酸化劑等，可調節畜禽腸胃微生態環境并進一步提高飼料利用率。發酵飼料氣味清香，提高了飼料的適口性，加上發酵飼料中有大約4℃的酒度，能夠促進動物新陳代謝促進健康抵御疾病，是當前養殖業發展中重要的一環。

本技術也可以同樣發酵菜籽粕（餅）、棕櫚粕等，方法同上。

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