復方中草藥飼料添加劑發酵工藝的研究
摘要：試驗研究復方中草藥發酵前后成分變化，為新型綠色飼料添加劑的研制提供參考。在單因素試驗設計基礎上，通過4因素3水平正交試驗設計對枯草芽孢桿菌發酵復方中草藥的條件進行優化。在紫外分光光度計625nm下檢測發酵前后復方中草藥多糖變化。試驗最終確定復方中草藥的最佳發酵工藝為料水比10.5，接菌量4%，時間48 h，溫度37 ℃，含糖量得到顯著提高。
關鍵詞：飼料添加劑；復方中草藥；枯草芽孢桿菌；多糖含量
目前，我國畜禽養殖業抗生素濫用現象相當嚴重[1]。雖然抗生素在提高生產效益上發揮了一定的積極作用，但其所導致的負面效應也越來越引起人們的關注。2006年1月1日，歐盟全面禁止抗生素作為飼料添加劑在畜禽養殖中的使用。面對世界各國逐步禁用抗生素飼料添加劑的趨勢，我國對綠色飼用抗生素替代品的需求亟待解決[2]。發酵炮制中草藥有著獨特的優勢。本研究選用馬齒莧、黃芪、黨參、麥芽、木香等中草藥按比例制成復方，用單因素和正交試驗相結合的試驗設計最終確定其最佳的發酵工藝，其中，發酵微生物為枯草芽孢桿菌，以復方中草藥發酵前后多糖含量變化為檢測指標，為飼用抗生素替代品的研制提供參考。
1· 材料與方法
1.1 試驗材料 菌種:枯草芽孢桿菌(購于保定瑞谷科技有限公司)。試驗原料：中草藥（均購自哈爾濱藥材市場）、酵母膏、蛋白胨、NaCl、瓊脂、蒸餾水、濃硫酸、鹽酸、蒽酮及其他試劑均為分析純（購自哈爾濱化學試劑公司）。
儀器：超凈工作臺（DL-CJ-ZND北京東聯哈爾一起制造公司）。
紫外分光光度計：SHIMADZUUV-2401PC。電熱恒溫培養箱（福瑪GHX-9880B-1）；高壓滅菌鍋（MLS-3020）。
1.2 試驗方法
1.2.1 葡萄糖標準曲線的繪制
將樣品葡萄糖在105 ℃烘箱中烘至恒重，使用分析天平稱取0.010 g于100 ml容量瓶中，用蒸餾水定容，搖勻，得到葡萄糖標準溶液。移液槍分別移取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 ml 葡萄糖標準溶液至干凈具塞試管內，加蒸餾水至1 ml。各試管加入硫酸蒽銅溶液（0.1 g蒽酮溶于100 ml 80%濃硫酸中）4 ml，沸水中加熱10 min，冷卻至室溫。
分光光度計在625 nm測其吸光度。對所得值進行線性回歸，得到回歸方程：y=83.93x+0.011，R2=0.998。
1.2.2 含糖量的測定
中草藥在烘箱中烘干后，粉碎，過60目篩，按比例配成27.5 g放入250ml三角瓶中用玻璃棒攪拌均勻，在無菌操作臺中紫外照射30 min。取三角瓶中中草藥粉末0.5 g放入250 ml三角瓶中，加入45ml 80%乙醇浸泡30 min，超聲30 min，用加有濾紙的漏斗過濾棄去濾液。過濾后中草藥殘渣再次放入250 ml三角瓶中，重復上述操作1次。將濾渣放入烘箱中烘干，加入2%鹽酸，沸水浴1 h，冷卻至室溫后過濾到100 ml容量瓶中，重復操作1次，合并濾液，用2%鹽酸定容。混勻，取1 ml中草藥提取液于25 ml容量瓶中，用2%鹽酸定容，取1ml于具塞試管中，加入4 ml硫酸蒽酮溶液，沸水浴10min,涼水冷卻至室溫，分光光度計625 nm下測定吸光度。得到未發酵復方中草藥含糖量為10.05%。
1.2.3 菌種的活化
取適量菌粉于滅菌生理鹽水中，在無菌操作臺里浸泡24 h后，接種到裝有枯草芽孢桿菌液體培養基的三角瓶里。放置到電熱恒溫震蕩培養箱，37 ℃，培養48 h。培養兩代后，對枯草芽孢桿菌進行平板計數，比較該菌正常活菌數（30億/g），來決定復壯次數。
1.2.4 復方中草藥的發酵
5種中草藥進行粉碎后過60目篩。取復方中草藥粉末27.5 g入250 ml三角瓶，在無菌操作臺中紫外滅菌30 min，按比例加入菌液、滅菌蒸餾水，用封口膜封好，在設定溫度下培養，篩選最適接菌量、料水比、時間、溫度，再進行正交試驗。
1.2.5 料水比對復方中草藥發酵的影響
每份稱取復方中草藥粉末27.5g，入250 ml三角瓶，每組3個重復。料水比分別為10.5，10.6，10.7，10.8，10.9，11，接菌量4%，培養時間72 h，培養溫度37 ℃，入電熱恒溫培養箱中培養。發酵后放入烘箱中烘干，粉碎過60 目篩后每份取0.5 g 樣品如1.2.2節方法測發酵藥物的多糖含量，確定最佳料水比。
1.2.6 接菌量對復方中草藥發酵的影響
每份稱取復方中草藥粉末27.5g，入250 ml三角瓶，每組3個重復。接菌量分別為2%、4%、6%、8%、10%、12%，料水比由1.2.5節確定，培養時間72 h，培養溫度37 ℃，入電熱恒溫培養箱中培養。發酵后放入烘箱中烘干，粉碎過60目篩后每份取0.5 g樣品如1.2.2節方法測發酵藥物的多糖含量，確定最佳發酵接菌量。
1.2.7 培養時間對復方中草藥發酵的影響
每份稱取復方中草藥粉末27.5g，入250 ml三角瓶，每組3 個重復。發酵時間分別為24、48、72、96、120、144 h，料水比由1.2.5節確定，接菌量由1.2.6節確定，培養溫度37 ℃，入電熱恒溫培養箱中培養。發酵后放入烘箱中烘干，粉碎過60目篩后每份取0.5 g樣品如1.2.2方法測發酵藥物的多糖含量，確定最佳發酵時間。
1.2.8 培養溫度對復方中草藥發酵的影響
每份稱取復方中草藥粉末27.5g，入250 ml三角瓶，每組3個重復。培養溫度為分別為29、31、33、35、37、39 ℃，料水比由1.2.5節確定，接菌量由1.2.6節確定，時間由1.2.7節確定，入電熱恒溫培養箱中培養。發酵后放入烘箱中烘干，粉碎過60目篩后每份取0.5 g樣品如1.2.2節方法測定發酵藥物的多糖含量，確定最佳發酵溫度。
1.2.9 正交試驗優化復方中草藥的發酵條件
在單因素試驗條件下確定適合復方中草藥發酵接菌量、料水比、溫度、時間的最適值，在此基礎上進行四因素三水平的正交試驗，發酵后放入烘箱中烘干，粉碎過60目篩后每份取0.5 g樣品如1.2.2節方法測發酵藥物的多糖含量，確定最佳發酵方案。
1.3 數據處理
試驗所得數據用SPSS19.0進行分析。
2· 結果與分析
2.1 料水比對復方中草藥發酵的影響
不同料水比對復方中草藥發酵的影響如圖1所示。由圖1可知，料水比為1：0.5，1：0.6時，藥物發酵后多糖含量逐漸增加，料水比1：0.6時多糖含量最高，之后多糖含量隨著水分的增加而減少，料水比為1：1時，發酵藥物多糖含量下降幅度較大。單因素條件下1：0.6為藥物發酵最佳料水比。
2.2 接菌量對復方中草藥發酵的影響
不同接菌量對復方中草藥發酵的影響如圖2所示。由圖2可知，接菌量為2%、4%、6%時發酵后藥物多糖含量逐漸升高，接菌量為6%、8%、10%、12%時發酵后藥物多糖含量逐漸降低。在單因素條件下6%為藥物發酵最佳接菌量。
2.3 時間對復方中草藥發酵的影響
不同時間對復方中草藥發酵的影響如圖3 所示。由圖3可知，培養時間在24~48h范圍內，發酵藥物多糖含量快速上升，培養時間在48~144 h范圍內，發酵藥物多糖含量逐漸降低。單因素條件下48 h為藥物發酵最佳時間。
2.4 溫度對復方中草藥發酵的影響
不同溫度對復方中草藥發酵的影響見圖4。由圖可知，溫度在29~35 ℃范圍內，發酵藥物多糖含量逐漸升高，35~39 ℃范圍內藥物多糖含量逐漸下降。單因素條件下，35 ℃為藥物發酵最佳溫度。
2.5 正交試驗優化復方中草藥的發酵條件
由單因素試驗確定正交試驗各因素的水平值，如表1，正交試驗操作表如表2，方差分析結果如表3。
由表2、表3可知，4個因素對發酵后復方中草藥多糖含量影響的主次順序為：D（溫度）>C（時間）>A（料水比）>B（接菌量），可知發酵工藝條件最佳組合為A1B1C2D3。方差分析結果表明D(溫度)、C（時間）對發酵試驗結果的影響極顯著(P<0.01)，A（料水比）對發酵試驗結果影響顯著(P<0.05)，B(接菌量）的影響不顯著（P>0.05）。發酵復方中草藥（馬齒莧、黃芪、黨參、麥芽、木香）的最佳工藝組合為：料水比10.5，接菌量4%，時間48 h，溫度37 ℃。此條件下發酵的復方中草藥多糖含量為17.98%。
3 ·討論
微生物在發酵中草藥的過程中，產生的酶類可以消化植物細胞壁，釋放活性物質[3-4]，降解有毒物質，產生新物質[5-6]。國家科技部已將中藥發酵工程列入“十五發展計劃”[7]，中草藥發酵技術具有廣闊的發展前景。
在發酵過程中，培養溫度是影響微生物生長的最重要因素之一[8]。參與細胞內生化反應酶的活性與溫度息息相關。當培養溫度低于微生物最佳生長溫度時，其生長速率大于死亡速率，降解中草藥基質產生較多的多糖，培養溫度高于最佳溫度時，微生物生長速率小于死亡速率，其他適宜雜菌的生長加快，枯草芽孢桿菌不再是優勢菌群，雜菌利用了基質中的多糖，降低基質中多糖含量。固體發酵時，隨著微生物的生長，會產生大量的熱，引起物料溫度的變化，一般情況下，固態發酵物料在一定溫度范圍內波動。由于試驗發酵所用物料很少（27.5 g），培養箱恒溫控制，可忽略發酵物料溫度的波動。但大規模發酵時，由于物料熱傳導性差，固態基質內部溫度變化大，直接影響菌群生長，所以要控制好發酵溫度，具體措施有待研究。
微生物發酵都有一個最佳時間階段[9]。在發酵過程中，產物的濃度是變化的，一般產物高峰生產階段時間越長，生產率也越高，但到一定時間產物產量會減緩，甚至下降。所以發酵時間不是越長越好。
水是細胞生命活動的內環境，物料含水量的變化會影響微生物的生長及代謝[10]。基質底物的含水率,必然影響發酵結果。微生物在固態基質上的生長取決于水活度(aw），水活度與培養基中水分含量有關，兩者的關系與溫度及物料性質有關，不是正比關系，但具體關系目前還沒有研究。每種微生物有屬于自己的最適aw。aw 值太低，微生物生長緩慢，甚至死亡。
隨著含水量的升高，導致基質中氧的傳質阻力升高，多孔性降低，減少了O2的供給，影響了枯草芽孢桿菌的生長，增加了污染雜菌的危險，以致雜菌消耗基質中的多糖，使多糖含量低于未發酵基質。在固態發酵基質中,水含量應控制在既能供微生物大量生長又低于雜菌生長所需要的程度,一般的固態發酵濕基含水量在50%左右[11]。
人工接種的微生物具有生長優勢，培養基中接入合適的菌量能縮短菌體的停滯期，使菌體生長快速進入生長對數期，進而縮短發酵周期；但是不適合的接種量可能使菌體處于停滯期的時間加長，菌體生長緩慢，其他雜菌趁機生長，影響基質的正常發酵。本研究結果顯示接菌量數值在一定范圍內浮動對發酵結果無顯著影響。
我國固態發酵技術歷史悠久，現代固態發酵工程在發酵工藝上進行了多方面的技術改進。固態發酵有著能耗低，產率高，污染小，后處理加工方便等優點。本試驗利用固態發酵復方中草藥的方法來研制新型飼料添加劑，為替代飼用抗生素提供一定的參考。
4· 結論
發酵復方中草藥（馬齒莧、黃芪、黨參、麥芽、木香）的最佳工藝組合為：料水比10.5，接菌量4%，時間48 h，溫度37 ℃。此條件下發酵復方中草藥提高多糖含量效果明顯。
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