發酵飼料對妊娠母豬產仔性能及糞便中微生物的影響
豬腸道內棲息著大量微生物。這些微生物菌群的組成與結構直接影響到營養物質的消化吸收和宿主健康。在正常情況下、豬腸道微生物群落的組成相對恒定，但在其遇到日糧、疾病及溫度的巨大變化時，豬消化道微生物群落的平衡會被打破，其生產性能也隨之受到影響。研究發現，妊娠期母豬由于激素等內分泌因子的變化，常引發腸道微生物菌群結構紊亂。誘發便秘，對母豬生產性能造成極大負面影響。因此，如何改善妊娠母豬腸道微生物菌群結構與組成、防止便秘的發生，已成為當前研究熱點。
發酵飼料是一類經有益微生物發酵．含有大量有益微生物、活性酶和未知生長因子的新型飼料。已有研究發現，這類飼料可促進仔豬生長．改善仔豬腸道微生態平衡，增強機體免疫力。然而，目前有關發酵飼料對母豬腸道健康及生產性能的影響的報道極少。因此，為深入闡明發酵飼料在母豬生產中的作用．本研究以妊娠母豬為研究對象．探究了飼喂發酵飼料對妊娠母豬的生產性能、糞便微生物發酵參數及微生物菌群的影響，擬為發酵飼料在母豬上的應用提供理論依據。
1 材料與方法
1．1 試驗設計
選取2～3胎次的妊娠85d左右的健康經產母豬16頭，隨機分為2組，每組8頭，分別為常規飼料組(對照組)和發酵飼料組(試驗組)。妊娠后期的日糧配方及營養水平見表1。發酵飼料的制作程序如下：采用保存于南京農業大學動物科技學院消化道微生物實驗室的唾液乳桿菌L79、枯草芽孢桿菌B1121和釀酒酵母菌S1145制備菌液。并按質量比2：2：1進行混合(復合菌的總數量約為1× 109cfu／g)，取對照組常規飼料，按2 g／kg復合菌液添加于飼料底物中．調節飼料濕度為40％，混合均勻后分裝至單通閥發酵袋中，于37℃發酵2d。基于2組所喂飼料的干物質量相同的基礎上。飼喂前以6％的比例與常規飼料混合，將混合飼料作為試驗組日糧。試驗期間，每日飼喂2次．自由采食和飲水。試驗期從妊娠85d開始。期間記錄母豬的產仔數、活仔數和初生仔豬的重量。
1．2 糞樣的采集與制備
在妊娠105 d，采集各組的新鮮糞便樣品，取部分糞樣按質量比1：1與去離子水混合，5000g離心10min后，部分上清液凍置于-20℃冰箱中，用于乳酸濃度的測定，另一部分上清液中以5：1的比例加入25％(W／V)偏磷酸與巴豆酸混合液，混勻后凍存于-20℃冰箱中過夜用于揮發性脂肪酸濃度的測定；取部分樣品于-20℃保存，用于細菌DNA提取。
1．3 糞便樣品中乳酸和揮發性脂肪酸的測定
乳酸含量采用乳酸測試盒(A019—2．南京某生物工程研究所)測定。測定揮發性脂肪酸的樣品解凍后，4℃、10000 g離心10min，于GC一14B型氣相色譜儀(Shimadzu)測定含量，具體方法參照文獻。
1．4 糞便樣品DNA的提取
糞便樣品DNA采用QIAamp Fast DNA Stool MiniKit(Qiagen)提取。稱取0．25 g糞便樣品置于鋯珠管中，與1mLInhibit Ex緩沖液及0.1g鋯珠(直徑0.1毫米)混勻，采用Mini-Beadbeater-1(BiospecProducts Inc)以4800r／min的速度混合20s，重復3次。將混合物于95℃的水浴鍋中水浴5min。水浴后的混合物離心1min，取上清液置于新的1.5mL離心管中，并加入15mL蛋白酶K。在Nanodrop 1000 spectrophotometer(Thermo Fishercientific)上測定DNA濃度及純度。
1．5 糞便微生物lllumina MiSeq測序
在IIIumina(MiSeq)平臺進行DNA雙端測序。使用細菌16S rRNA基因的V3-V4區作為模板．進行PCR擴增．引物序列為341F(5’-barcode—CCTA．YGGGRBGCASCAG-3’)和806R(5’-barcode—GGACTACCVGGGTATCTAAT-3’)。擴增條件為：95℃2 min；95℃1 min，55℃1 min，72℃1 min，25個循環；72 ℃5 min。測序得到的序列通過QIIME(v．1．8．0)軟件進行分析。將不含樣品信息的序列、過短或過長的序列、出現ambiguous堿基及含有過多homologous堿基的序列去除。在97％的相似度水平上利用UPARSE對非重復序列進行OTU歸類操作。利用稀疏曲線評價樣品的覆蓋率和取樣深度：使用Alpha多樣性指數：ACE、Chao、Shannon和Simpson進行單樣本的多樣性分析：利用未加權的PCoA計算樣本間的差異性。
1．6 統計分析
試驗所得數據經Excel(2010)初步處理后，常規數據采用SPSS 20．0軟件中的獨立樣本t檢驗方法進行分析，高通量測序結果采用Kruskal—WaIIis進行非參數檢驗。顯著性水平(P值)置于0．05。
2 結果與分析
2．1 母豬的生產性能
如表2所示，與對照組相比，飼喂發酵飼料對母豬的總產仔數、活仔數和平均初生重無顯著影響(P>0.05)。
2．2 母豬糞便樣品的發酵參數
糞便的乳酸及揮發性脂肪酸的含量如表3所示。與對照組相比，飼喂發酵飼料對糞便中的乳酸和丙酸含量無顯著影響(P>0．05)。與對照組相比，飼喂發酵飼料顯著提高了糞便中乙酸、丁酸、異丁酸、異戊酸和戊酸的含量(P<0.05)。
2．3 母豬糞便微生物菌群的豐富度和多樣性的變化
稀疏曲線結果顯示，各樣品中的微生物的稀疏曲線趨于平緩，說明取樣合理，測序深度足以反映檢測樣品的菌群多樣性(圖1A)。主坐標分析結果顯示，2組樣品無法明顯區分開，說明2組間的微生物菌群存在一定的相似性(圖1B)。如表4所示，與對照組相比，飼喂發酵飼料對母豬糞便微生物的OTU數、ACE、Chao指數、Shannon指數和Simpson指數均無顯著影響(P>0.05)。
2．4 母豬糞便細菌菌群組成的變化
在門水平上，糞便樣品共檢測到19個菌門。2組的優勢菌門均為Bacteroidetes、Firmicutes和Spirochaetae，占糞便細菌菌群組成的91％以上。如表5所示，與對照組相比，飼喂發酵飼料顯著降低了Fibrobacteres的相對豐度(P<0.05)。在屬水平上．共檢測到262個屬，其中有20個菌屬的相對豐度大于1％。這20個屬的分析結果在表6展示。與對照組相比，飼喂發酵飼料顯著降低了Oscillospira和Fibrobacter的相對豐度(P<0.05)，有提高Blautia和Bacteroides相對豐度的趨勢(P<0.1)。
3 討 論
發酵飼料作為一類新型飼料，其在仔豬生產中得到廣泛應用。研究發現，仔豬日糧中添加發酵飼料，可顯著提高斷奶仔豬的成活率和平均斷奶重，降低哺乳仔豬的腹瀉率，從而提高母豬的生產性能。但目前有關發酵飼料對母豬生產性能的影響的報道較少，本研究發現，飼喂發酵飼料對母豬產仔數、活仔數以及仔豬初生重無顯著影響．結果說明母豬窩產仔數等生產性能指標更易受妊娠早期胚胎存活率的影響。
豬腸道微生物主要棲息于消化道后段．胃和小腸未消化吸收的營養素進入后腸，經微生物發酵，產生大量發酵產物，進而可被機體吸收。發酵產物進入機體可起到供能及調控宿主代謝與免疫的作用。本試驗中，飼喂發酵飼料顯著提高了糞便中乙酸和丁酸的含量。在這些揮發性脂肪酸中．乙酸可作為肝臟和外周組織的能量來源．也可作為糖原異生和脂肪生成代謝途徑中的信號分子。丁酸是結腸細胞的主要能量來源．可以預防炎癥，同時其還可抑制腸道內的病原菌或腐敗菌生長，促進益生菌的生長和增殖。有研究發現，丁酸在腸上皮細胞凋亡和增殖的調節中發揮重要作用。本研究表明，飼喂發酵飼料促進了母豬腸道微生物發酵，提高了糞便中揮發性脂肪酸的含量，因而對改善母豬腸道健康具有重要作用。
本研究發現，飼喂發酵飼料影響了母豬腸道微生物菌群的組成。與對照組比較，試驗組母豬糞便中的Oscillospira和Fibrobacter屬的微生物的相對豐度顯著降低，Blautia和Bacteroides的相對豐度有升高的趨勢。Blautia是結腸中存在的一種產乙酸菌，其豐度的升高與糞便中乙酸含量升高相一致。Bacteroides是腸道中普遍存在的一種菌，據報道，Bacteroides屬微生物可以消化一些宿主難以消化的多糖，從而為機體供能。最近有研究表明，飼喂微生物發酵飼料增加了斷奶仔豬腸道菌群中的Bacteroides屬微生物的比例。該結果也與本試驗的研究結果一致。Fibrobacter是一類纖維降解菌．其具有高纖維素分解活性．并且能夠降解難降解的植物結構多糖。Fibrobacter在試驗組含量降低的原因可能是由于飼料經過益生菌發酵后，纖維素的含量降低，殘留的纖維素被其他纖維降解菌分解所致。Oscillospira是結腸中一種常見菌，生長緩慢，有研究指出，這種緩慢生長關系著結腸的蠕動，并與便秘發生與否成正相關。本試驗中，飼喂發酵飼料導致Oscillospira屬微生物的豐度下降，暗示發酵飼料可能有利于降低母豬便秘的發生，從而有益于腸道健康。
4 結 論
綜上所述，飼喂發酵飼料可以平衡母豬腸道微生態，對腸道健康有益生作用，但對母豬的產仔性能未產生顯著影響。
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