微生物發(fā)酵爆破秸稈降解纖維素的研究
木質(zhì)纖維素是地球上數(shù)量最大的可再生能源物質(zhì)，據(jù)初步統(tǒng)計，全世界每年產(chǎn)量大約為100億t，其中農(nóng)作物秸稈的產(chǎn)量為70億t。然而，植物細胞壁中半纖維素和木質(zhì)素的復(fù)雜結(jié)構(gòu)及其對纖維素的包裹作用限制了秸稈資源在畜牧業(yè)生產(chǎn)中的大量應(yīng)用。目前，在工業(yè)和飼料生產(chǎn)中實際使用的秸稈大約占總量的30％，其余大部分都被直接燃燒或丟棄，造成了很大的資源浪費和環(huán)境污染。因此，促進秸稈中纖維成分的降解，合理地利用秸稈資源，對于畜牧業(yè)生產(chǎn)和經(jīng)濟發(fā)展具有非常重要的意義。
生物處理是一種安全、環(huán)境友好、低能耗的傳統(tǒng)的秸稈處理方法。然而，較低的水解效率和較長的反應(yīng)時間限制了其在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用。為了提高生物處理的效果，必須采取一些物理或化學(xué)的預(yù)處理方法來軟化或破壞木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)。蒸汽爆破是采用飽和水蒸汽加熱原料至一定的壓力，然后驟然減壓至大氣壓的生物質(zhì)預(yù)處理手段。蒸汽爆破預(yù)處理可使原料中大部分半纖維素、少量木質(zhì)素和纖維素降解而溶出，有利于后續(xù)纖維素酶對纖維素的降解，是玉米秸稈預(yù)處理的有效方法之一，規(guī)模化的生產(chǎn)可以節(jié)省能耗和成本。許多研究表明，蒸汽爆破處理可以提高動物對谷物秸稈的消化率。目前，國內(nèi)外將秸稈爆破技術(shù)應(yīng)用到動物飼料生產(chǎn)方面的研究較少。鑒于此，將秸稈爆破預(yù)處理和微生物發(fā)酵相結(jié)合，并對爆破秸稈微生物發(fā)酵生產(chǎn)動物飼料的發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，旨在為秸稈飼料資源的開發(fā)及其在畜牧業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。
1材料與方法
1.1 試驗材料
玉米秸稈經(jīng)粉碎機粉碎后，過5 mm篩備用。試驗所用米曲霉菌種為河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)與生物技術(shù)實驗室分離、鑒定和保存。
1.2試驗設(shè)備
秸稈蒸汽爆破機為LB系列數(shù)控立式連續(xù)汽爆機。
1.3 試驗方法
1.3.1 原料預(yù)處理
玉米秸稈在秸稈爆破機中于2.5 MPa下維壓200 S，然后在0.008 75 s內(nèi)突然釋放壓力，進行爆破預(yù)處理，處理后的樣品自然晾曬于燥備用。
1.3.2 種曲的制備和培養(yǎng)
將分離純化后的米曲霉菌株接種到PDA培養(yǎng)基中，30℃條件下靜止培養(yǎng)3 d，然后用無菌加有吐溫的生理鹽水沖洗平板，輕輕將瓊脂平面上的孢子刮下，轉(zhuǎn)移到已經(jīng)滅菌的三角瓶中，采用平板計數(shù)法計算種曲孢子密度為1×106個/mL左右。
1.3.3 試驗設(shè)計與分組
正交試驗設(shè)計見表1。
營養(yǎng)液的配比為：尿素25％、葡萄糖25％、磷酸二氫鉀12.5％、硫酸鎂12.5％、硫酸錳10％、硫酸鋅10％、氯化鈷5％。
以上培養(yǎng)基用2％的Ca(OH)：諷整pH值為中性后，121℃高壓滅菌15 min，按照固液比1：1.5，接種量為4％進行接種，30℃培養(yǎng)6 d，測定發(fā)酵后產(chǎn)品的纖維素降解率、濾紙酶活性和羧甲基纖維素(CMC)酶活性。
1.3.4 理化指標的測定
發(fā)酵后的秸稈樣品，在50℃條件下烘干至恒質(zhì)量，一部分用于測定秸稈中纖維素含量。另取4.0 g發(fā)酵樣品，加入36 mL生理鹽水浸泡2 h后，3 000 r/min離心10 min，取上清液作為粗酶液，測定其濾紙酶活性和CMC酶活性。
秸稈中纖維含量的測定采用范氏(Van Soest)纖維測定方法。
濾紙酶活性的測定：取粗酶液和煮沸10 min滅活的酶液各0.5 mL，加入1.5 mL濃度為0.05mol/L、pH值為4.5的檸檬酸緩沖液和50 mg濾紙條，于50℃條件下水浴保溫1 h，然后加入1.5 mL的DNS顯色液，煮沸5 min，以滅活酶組為對照，在波長550 nm處測定吸光度。酶活性單位定義為：以水解反應(yīng)每小時催化底物水解形成1 μmol葡萄糖的酶量為1個單位。
CMC酶活性的測定：取粗酶液和煮沸10 min滅活的酶液各0.5 mL，加入1.5 mL質(zhì)量分數(shù)為0.51％的CMC檸檬酸緩沖液中，在50℃恒溫水浴鍋中酶解30 min，加入1.5 mL DNS顯色液終止反應(yīng)，充分混勻后，沸水浴15 min，以滅活酶組為對照，在波長550 nm處測定吸光度。
1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析
試驗數(shù)據(jù)均以“平均值±標準差”(mean±SD)表示，結(jié)果用SAS統(tǒng)計軟件中ANOVA過程進行方差分析，并進行Duncan多重比較，P<0.05為差異顯著。
2結(jié)果與分析
2.1 發(fā)酵爆破玉米秸稈中纖維素降解最優(yōu)培養(yǎng)基的確定
由表2可知，秸稈發(fā)酵纖維素降解率最高的條件為：爆破玉米秸稈83.5％、玉米5.0％、麩皮2.5％、豆粕5.0％、營養(yǎng)液4.0％。營養(yǎng)液的R值最高，其次為麩皮和豆粕，玉米的R值最小，表明培養(yǎng)基成分對纖維素降解的影響程度依次為營養(yǎng)液、麩皮、豆粕和玉米，營養(yǎng)液是影響纖維素降解的最主要因素。
由表3可知，營養(yǎng)液、豆粕和玉米的不同水平對纖維素降解的影響達到了極顯著水平(P
2.2 發(fā)酵爆破玉米秸稈中濾紙酶活性最優(yōu)培養(yǎng)基的確定
由表4可知，玉米、麩皮、豆粕、營養(yǎng)液的最高κ值分別在水平3、水平2、水平3、水平3。培養(yǎng)基中成分對濾紙酶產(chǎn)生的影響程度依次為營養(yǎng)液、麩皮、玉米和豆粕，營養(yǎng)液是影響濾紙酶產(chǎn)生的最主要因素。
由表5可知，營養(yǎng)液和麩皮的不同比例對濾紙酶活性的影響達到了顯著水平(P
2.3 發(fā)酵爆破玉米秸稈中CMC酶活性最優(yōu)培養(yǎng)基的確定
CMC酶活性優(yōu)化培養(yǎng)基為：爆破玉米秸稈86.0％、玉米2.5％、麩皮2.5％、豆粕5.0％、營養(yǎng)液4.0％。營養(yǎng)液的R值最高，其次為豆粕和玉米，麩皮的R值最小，這表明培養(yǎng)基成分對CMC酶活性產(chǎn)生的影響程度依次為營養(yǎng)液、豆粕、玉米和麩皮，營養(yǎng)液是影響CMC酶產(chǎn)生的最主要因素。
由表7可知，營養(yǎng)液、豆粕、玉米和麩皮的不同比例對CMC酶活性的影響均達到了顯著水平(P<0.05)。
3討論
本試驗中，纖維素降解率最高的組合為A3B2G3D3，濾紙酶和CMC酶活性產(chǎn)生最高的組合分別為A3B2C3D3和A2B2C3D3。濾紙酶活性產(chǎn)生最高的組合，纖維素的降解率也最高。
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