2.1 基料制備實驗結果與分析

2.1.1 單因素實驗

在基料制備過程中，為使啤酒酵母和乳酸菌始終保持最佳生長狀態，固定發酵時間為5d，通過Plactett-Burman實驗選取顯著影響基料總菌落數的4個因素(仁渣目數、菌料比、發酵溫度、含水量)設計單因素實驗。

2.1.1.1 仁渣目數的影響

在菌料比(質量比，下同)1∶80，發酵溫度28℃，含水量30%，棕櫚仁渣目數分別為10、20、40、60、80目條件下，測定基料中總菌落數，分析仁渣目數對啤酒酵母和乳酸菌發酵棕櫚仁渣的影響，結果見圖1。注:圖中相同字母表示總菌落數之間差異不顯著(P＞0.05)，不同字母表示差異顯著(P＜0.05)，下同。圖1仁渣目數對總菌落數的影響由圖1可知，當棕櫚仁渣目數在10～60目時，基料中總菌落數隨著棕櫚仁渣目數增大而顯著增多(P＜0.05)，當棕櫚仁渣目數在60～80目時，基料中總菌落數隨著棕櫚仁渣目數增大而顯著降低(P＜0.05)，這可能是由于當棕櫚仁渣目數為60目時，啤酒酵母和乳酸菌與棕櫚仁渣有效接觸面積趨于最大，隨后棕櫚仁渣因自重影響發生粘黏，有效接觸面積減少，啤酒酵母和乳酸菌無法充分利用棕櫚仁渣營養物質生長發酵。故棕櫚仁渣目數選擇60目為宜。

2.1.1.2 菌料比的影響

在仁渣目數60目，發酵溫度28℃，含水量30%，菌料比分別為1∶80、1∶90、1∶100、1∶110、1∶120條件下，測定基料中總菌落數，分析菌料比對啤酒酵母和乳酸菌發酵棕櫚仁渣的影響，結果見圖2。

由圖2可知，當菌料比在1∶80～1∶100時，基料中總菌落數隨著菌料比的增大呈顯著增加趨勢(P＜0.05)，繼續增大菌料比，總菌落數顯著降低(P＜0.05)，這可能是棕櫚仁渣營養物質已被啤酒酵母和乳酸菌分解利用完畢，微生物細胞停止生長甚至開始死亡所造成的結果。因此，菌料比選擇1∶100為宜。

2.1.1.3 發酵溫度的影響

在仁渣目數60目，菌料比1∶100，含水量30%，發酵溫度分別為24、26、28、30、32℃條件下，測定基料中總菌落數，分析發酵溫度對啤酒酵母和乳酸菌發酵棕櫚仁渣的影響，結果見圖3。

由圖3可知，當發酵溫度在24～30℃時，基料中總菌落數隨著發酵溫度的上升呈顯著增加趨勢(P＜0.05)，繼續升高發酵溫度，總菌落數略有降低(P＞0.05)，這是因為隨著溫度的升高酶反應速度加快，啤酒酵母和乳酸菌細胞生長代謝加快，當溫度高于30℃時酶失活速率大于微生物細胞生長代謝速率，導致微生物細胞衰老加快。故發酵溫度選擇30℃為宜。

2.1.1.4 含水量的影響

在仁渣目數60目，菌料比1∶100，發酵溫度30℃，含水量分別為30%、35%、40%、45%、50%條件下，測定基料中總菌落數，分析含水量對啤酒酵母和乳酸菌發酵棕櫚仁渣的影響，結果見圖4。

由圖4可知，當含水量由30%增至35%時，基料中的總菌落數隨著含水量的增大而顯著增加(P＜0.05)，隨著含水量的繼續增加，總菌落數呈逐漸降低趨勢(P＜0.05)，這可能是由于適宜的含水量使得棕櫚仁渣的細小顆粒之間存在一定的空隙和合適的疏松度，有利于微生物進入，在增大微生物與棕櫚仁渣表面接觸面積的同時排出微生物菌體代謝所產生的CO2，促進微生物菌體生長。故含水量選擇35%為宜。

2.1.2 響應面優化實驗

2.1.2.1 響應面實驗設計及結果

在單因素實驗基礎上，采用中心組合設計原理，以仁渣目數(A)、菌料比(B)、發酵溫度(C)和含水量(D)為響應變量，基料中總菌落數為響應值，采用Box-Behnken設計進行四因素三水平的響應面優化實驗，響應面優化實驗共設計29個實驗點。Box-Behnken實驗因素水平見表2，Box-Behnken實驗設計及結果見表3。

利用Design Expert10.0.4軟件對表3實驗數據進行多元回歸擬合，得到總菌落數對仁渣目數、菌料比、發酵溫度和含水量的二次多項式回歸方程:總菌落數=7.35+0.22A+1.22B+0.41C+0.28D+0.011AB-0.002AC-0.12AD+0.015BC-0.18BD-0.017CD-0.13A2-3.86B2-1.29C2-0.72D2。

該模型的分析結果及模型系數顯著性檢驗見表4。

由表4可知，二次回歸模型F值為154.690，P＜0.0001，表明模型極顯著。失擬項P=0.3088＞0.05，失擬項差異不顯著，說明實驗數據均可用此回歸模型描述，未知因素對實驗結果影響很小。模型決定系數R2=0.9936，說明99.36%的實驗數據變異性均可用此回歸模型解釋，模型可信度較高，該方程能很好地與實際情況擬合，較好地反映了基料中總菌落數與仁渣目數、菌料比、發酵溫度和含水量之間的關系，因此該回歸方程可較好預測總菌落數隨各參數的變化規律。校正系數R2Adj=0.9872，說明實驗結果有98.72%受各因素的影響。綜上所述，該模型可用于總菌落數分析和預測。通過表4中F值可判斷各自變量對因變量的影響依次為B＞C＞D＞A，即菌料比對總菌落數的影響最大(P＜0.01)，其次為發酵溫度(P＜0.01)、含水量(P＜0.01)和仁渣目數(P＜0.01)。由回歸方程和方差分析可知，二次項中B2、C2、D2對總菌落數的影響達極顯著水平(P＜0.01)。

2.1.2.2 工藝條件的優化

根據Box-Behnken實驗結果，結合回歸模型，預測基料制備的最佳工藝條件為棕櫚仁渣目數75.92目、菌料比1∶103.14、發酵溫度30.81℃、含水量35.53%，此條件下總菌落數為7.58×1010個/g。

2.1.2.3 模型驗證

為了驗證響應面模型的可預見性，同時為了簡化實驗操作，將基料制備工藝的最佳發酵條件修正為棕櫚仁渣目數70目、菌料比1∶103、發酵溫度30℃、含水量36%，該條件下進行3次平行實驗，總菌落數達到7.2×1010個/g，RSD為4.42%，與模型預測值誤差為5.01%。經SPSS下ANOVA分析，驗證實驗總菌落數與預測總菌落數差異不顯著(P=0.056＞0.05)。說明該模型可以有效預測基料制備過程中的總菌落數，優化結果可靠，可用來指導啤酒酵母和乳酸菌對棕櫚粕渣的發酵工藝。

2.2 發酵產物實驗結果與分析

2.2.1 單因素實驗

在產物發酵過程中，為使發酵產物的營養成分歸一值達到最好，固定發酵溫度為30℃，棕櫚果渣與空果串配比為1∶2。通過Plactett-Burman實驗選取顯著影響發酵產物營養成分OD值的4個因素(棕櫚果渣及空果串的粉碎長度(以下簡稱粉碎長度)、基料與棕櫚果渣和空果串配料比(以下簡稱配料比)、含水量、發酵時間)設計單因素實驗。

2.2.1.1 粉碎長度的影響

在配料比1∶8(質量比，下同)，含水量30%，發酵時間30d，粉碎長度分別為1、3、5、7、9cm條件下，測定發酵產物OD值，分析粉碎長度對發酵產物營養成分的影響，結果見圖5。

 

由圖5可知，當粉碎長度在1～5cm時，發酵產物營養成分OD值隨粉碎長度的增長而呈顯著增加趨勢(P＜0.05)，繼續增長粉碎長度，營養成分OD值開始顯著降低(P＜0.05)，這說明棕櫚果渣和空果串粉碎長度過長，會致使其與基料混合不均勻，從而影響啤酒酵母和乳酸菌對棕櫚果渣和空果串的發酵。故粉碎長度選擇5cm為宜。

2.2.1.2 配料比的影響

在粉碎長度5cm，含水量30%，發酵時間30d，配料比分別為1∶8、1∶9、1∶10、1∶11、1∶12條件下，測定發酵產物OD值，分析配料比對發酵產物營養成分的影響，結果見圖6。

由圖6可知，當配料比在1∶8～1∶10時，發酵產物營養成分OD值隨配料比的增大而呈顯著增加趨勢(P＜0.05)，繼續增大配料比，營養成分OD值顯著降低(P＜0.05)，這說明配料比過小，會致使菌落數劇增過快，從而產生過多的代謝廢物，導致菌種容易衰老，不利于發酵產物營養成分的提高，配料比過大，總菌落增長緩慢，培養時間長，使發酵周期延長，導致發酵成本的提升，同時會降低菌種活力，從而使菌種降解底物能力下降，營養成分含量降低。配料比為1∶10時，既能保證合理縮短發酵周期，又能得到較高的營養成分含量。故配料比選擇1∶10為宜。

2.2.1.3 含水量的影響

在粉碎長度5cm，配料比1∶10，發酵時間30d，含水量分別為25%、30%、35%、40%、45%條件下，測定發酵產物OD值，分析含水量對發酵產物營養成分的影響，結果見圖7。

由圖7可知，當含水量在25%～35%時，發酵產物營養成分OD值隨含水量的增大呈顯著增加趨勢(P＜0.05)，繼續加大含水量，發酵產物營養成分OD值顯著降低(P＜0.05)，這可能是由于含水量過低，導致固態介質中營養成分溶解度的下降及較低的基質膨潤度，微生物生長受抑制，營養成分轉換率降低，而含水量過高，導致基質顆粒間孔隙率的降低、黏性增加，增加了微生物菌體代謝所產生的CO2的傳質阻力，抑制微生物生長發酵。故含水量選擇35%為宜。

2.2.1.4 發酵時間的影響

在粉碎長度5cm，配料比1∶10，含水量35%，發酵時間分別為25、30、35、40、45d條件下，測定發酵產物OD值，分析發酵時間對發酵產物營養成分的影響，結果見圖8。

由圖8可知，當發酵時間在25～35d時，發酵產物營養成分OD值隨發酵時間的延長而顯著上升(P＜0.05)，繼續延長發酵時間，發酵產物營養成分OD值呈平緩上升趨勢(P＞0.05)，這是由于發酵過程中，產物營養成分濃度始終在變化，一般高峰生長階段時間越長，其生產率越高，但到一定時間后生產率提高緩慢。為了獲得更多的產物營養成分，時間過短，不足以獲得所需的優質發酵產品;時間過長，由于環境已不利于菌體生長，往往會造成菌體消溶，同時增加生產成本。因此，發酵時間選擇35d為宜。

2.2.2響應面優化實驗

2.2.2.1響應面實驗設計及結果

在單因素實驗基礎上，采用中心組合設計原理，以粉碎長度(X1)、配料比(X2)、含水量(X3)和發酵時間(X4)為響應變量，發酵產物營養成分OD值為響應值，采用Box-Behnken設計進行四因素三水平的響應面優化實驗，響應面優化實驗共設計29個實驗點。Box-Behnken實驗因素水平見表5，Box-Behnken實驗設計及結果見表6。

利用DesignExpert10.0.4軟件對表6實驗數據進行多元回歸擬合，得到粉碎長度、配料比、含水量和發酵時間的二次多項式回歸方程:OD值=0.95-0.025X1+0.17X2+0.026X3+0.049X4+0.001X1X2+0.026X1X3+0.024X1X4-0.021X2X3+0.002X2X4-0.005X3X4-0.019X21-0.53X22-0.088X23-0.18X24。

該模型的分析結果及模型系數顯著性檢驗見表7。

由表7可知，二次回歸模型F值為162.210，P＜0.0001，表明模型極顯著。失擬項P=0.2341＞0.05，失擬項差異不顯著，說明實驗數據均可用此回歸模型描述，未知因素對實驗結果影響很小。模型決定系數R2=0.9939，說明99.39%的實驗數據變異性均可用此回歸模型解釋，模型可信度較高，該方程能很好地與實際情況擬合，較好地反映了發酵產物營養成分OD值與粉碎長度、配料比、含水量、發132CHINAOILSANDFATS2020Vol.45No.3酵時間之間的關系，因此該回歸方程可較好預測發酵產物營養成分OD值隨各參數的變化規律。校正系數R2Adj=0.9877，說明實驗結果有98.77%受各因素的影響。綜上所述，該模型可用于發酵產物營養成分OD值分析和預測。通過表7中F值可判斷各自變量對因變量的影響依次為X2＞X4＞X3＞X1，即配料比對發酵產物營養成分OD值的影響最大(P＜0.01)，其次為發酵時間(P＜0.01)、含水量(P＜0.05)和粉碎長度(P＜0.05)。由回歸方程和方差分析可知，二次項中X22、X23、X24對發酵產物營養成分OD值的影響達極顯著水平(P＜0.01)。

2.2.2.2 工藝條件的優化

根據Box-Behnken實驗所得結果，結合回歸模型，預測發酵產物制備的最佳工藝條件為粉碎長度3.94cm、配料比1∶10.16、含水量35.23%、發酵時間35.50d，此條件下OD值為0.976。

2.2.2.3 模型驗證

為了驗證響應面模型的可預見性，同時為了簡化實驗操作，將發酵產物制備工藝的最佳發酵條件修正為粉碎長度4cm、配料比1∶10、含水量35%、發酵時間36d，該條件下進行3次平行實驗，OD值為0.966，RSD為1.66%，與模型預測值誤差為1.02%。經SPSS下ANOVA分析，驗證實驗OD值與預測OD值差異不顯著(P=0.376＞0.05)。說明該模型可以有效預測發酵產物營養成分，優化結果可靠，可用于指導啤酒酵母和乳酸菌對棕櫚粕渣飼料的發酵工藝。

2.3 成分分析

優化條件下對基料和發酵產物進行主要成分分析，結果見表8。

 

由表8可知:棕櫚仁渣經啤酒酵母和乳酸菌發酵后，粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、粗灰分、鈣、磷、含水量分別為18.63%、17.50%、6.50%、3.86%、0.80%、0.78%、35.12%，總菌落數為7.2×1010個/g;發酵產物的粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、粗灰分、鈣、磷、含水量分別為7.20%、7.61%、26.20%、5.20%、0.38%、0.26%、16.20%，總菌落數為9.0×107個/g。

通過發酵產物替代部分傳統粗飼料中玉米秸稈后進行肉牛喂養實驗，肉牛健康狀況良好，飼料消化吸收利用率高，育肥效果顯著。因此，該研究可為啤酒酵母和乳酸菌應用于棕櫚粕渣發酵飼料工業及棕櫚粕渣資源高值化利用提供理論指導及依據。

3結論