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3種添加劑對花鱸消化酶活力、前腸組織結構及營養物質表觀消化率的影響

2020-08-27 14:17:24      點擊:1946

摘要:本試驗旨在研究飼料中添加復合核苷酸、植酸酶或復合芽孢桿菌對花鱸消化酶活力、前腸組織結構及營養物質表觀消化率的影響。選取320尾初始體質量為(13.50±0.09)g的花鱸幼魚,隨機分成4組,每組4個重復,每個重復20尾。對照組(G0組)飼喂基礎飼料,3個試驗組分別飼喂在基礎飼料中添加0.06%復合核苷酸(G1組)、0.04%植酸酶(G2組)、0.10%復合芽孢桿菌(G3組)的試驗飼料。飼養周期為56d。結果顯示:各試驗組前腸、肝臟和胃的蛋白酶活力與G0相比無顯著差異(P>0.05)。G2組的肝臟淀粉酶活力顯著高于G0組(P<0.05);G1組的前腸脂肪酶活力顯著低于G0組(P<0.05);各組間前腸和胃淀粉酶、肝臟和胃脂肪酶活力差異不顯著(P>0.05)。飼料中添加3種添加劑均能顯著增加前腸肌層厚度和絨毛高度(P<0.05),增加固有層和上皮細胞間的緊密度,其中以植酸酶效果最為顯著。與G0組相比,G1組的干物質表觀消化率顯著升高(P<0.05);粗蛋白質、粗脂肪和總能表觀消化率各組間差異不顯著(P>0.05)。與G0組相比,G1和G3組粗灰分表觀消化率顯著升高(P<0.05),G2組粗灰分表觀消化率則顯著降低(P<0.05)。由此可見,飼料中添加植酸酶能顯著提高花鱸肝臟淀粉酶活力和干物質表觀消化率,顯著降低粗灰分表觀消化率;飼料中添加復合核苷酸能顯著降低花鱸前腸脂肪酶活力,顯著提高粗灰分表觀消化率;此外,飼料中添加復合核苷酸、植酸酶或復合芽孢桿菌均能改善花鱸前腸組織結構。

在飼料工業中,尤其是水產飼料中,節約魚粉是亟待解決的重要問題。我國是農業大國,可作為水產飼料的植物蛋白質源的品種眾多,來源廣泛,價格低廉。隨著魚粉資源日益枯竭以及魚粉價格的不斷升高,植物蛋白質作為魚粉替代源越來越受到人們的重視,高水平植物蛋白質或無魚粉飼料將是未來的發展趨勢。而對于肉食性魚類來說,飼料中過高水平的植物蛋白質飼料會導致魚體代謝紊亂,進而產生脂肪肝等營養代謝性疾病,影響其生長性能甚至導致死亡。研究認為,這種主要與植物蛋白質含有抗營養因子、適口性差等有關,從而限制了植物蛋白質在水產飼料中的利用量。但有研究發現,可通過在水產動物飼料中添加如外源酶制劑、核苷酸、益生菌等添加劑來改善植物蛋白質的應用效果。  

本團隊前期開展了花鱸(Lateolabrax japonicus)對豆粕、花生粕、棉籽粕、菜籽粕和玉米干酒糟及其可溶物(DDGS)5種植物蛋白質源營養物質表觀消化率的影響研究,結果發現,花鱸對豆粕和花生粕的營養物質表觀消化率與魚粉比較接近;當等氮替代16%魚粉(基礎飼料含40%魚粉)時,豆粕效果最好,其次是花生粕。為提高豆粕和花生粕在花鱸飼料中的利用率,本試驗以28%魚粉、30%豆粕和15%花生粕為主要蛋白質源配制基礎飼料,并分別添加復合核苷酸、植酸酶、復合芽孢桿菌3種添加劑,研究其對花鱸消化酶活力、前腸組織結構及營養物質表觀消化率的影響,旨在為提高植物蛋白質源在花鱸飼料中的應用提供有效途徑,并為花鱸實用飼料的配制提供參考。

1材料與方法

1.1 試驗材料  

晶體賴氨酸純度為78.8%,晶體蛋氨酸純度為99%,由廣州某生物科技有限公司提供;植酸酶活力為2500U/g,由廣東某生物科技有限公司提供;復合核苷酸中腺苷酸二鈉(AMPNa2)∶鳥苷酸二鈉(GMPNa2)∶胞苷酸二鈉(CMPNa2)∶尿苷酸二鈉(UMPNa2)=1∶1∶1∶1,由南京某生物技術有限責任公司提供;復合芽孢桿菌(枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌)中益生菌數量為5×109CFU/g,由湛江某飼料有限公司提供。

1.2 試驗設計與飼料組成  

以魚粉、豆粕和花生粕為主要蛋白質源,以魚油和豆油為主要脂肪源配制含有28%魚粉、30%豆粕和15%花生粕的基礎飼料,其組成及營養水平見表1。在基礎飼料中分別添加0.06%復合核苷酸、0.04%植酸酶、0.10%復合芽孢桿菌配制3種試驗飼料。各飼糧中均添加0.04%三氧化二釔(Y2O3)作為指示劑。飼料原料經粉碎后過60目篩,Y2O3、維生素和礦物質等微量成分按逐級擴大法混勻,然后加入魚油、豆油、水混勻,用SLX-80型雙螺桿擠壓機制成直徑為2.5mm的顆粒,50℃烘7~8h,自然冷卻后裝入密封袋,置于-20℃冰箱中保存備用。

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1.3 試驗魚和飼養管理  

花鱸幼魚購自福建詔安縣英港育苗場。試驗前暫養在室外水泥池,每天飽食投喂商品料2次,暫養4周。選取體質量為(13.50±0.09)g的花鱸幼魚320尾,隨機分為4組,每組4個重復,每個重復20尾魚。飼養試驗在廣東省農業科學院動物科學研究所室內循環水養殖系統進行,對照組(G0組)飼喂基礎飼料,3個試驗組分別飼喂在基礎飼料中添加0.06%復合核苷酸(G1組)、0.04%植酸酶(G2組)、0.10%復合芽孢桿菌(G3組)的試驗飼料。養殖系統是由16個直徑為80cm、高為70cm、容積為350L(水體容積為300L)的玻璃纖維桶構成。養殖水源為經過活性炭、珊瑚石過濾后的自來水,流水速率設置為4~5L/min,養殖過程中24h連續充氧曝氣,每天分別在09:00和18:00投喂飼料,采用表觀飽食投喂法,同時根據攝食情況及時調整投飼量。每周換水2次,每次換水量為1/3。飼養期間水溫為27.5~32.5℃,溶氧濃度>6.0mg/L,pH7.3~7.6,氨氮濃度<0.10mg/L,亞硝酸鹽濃度<0.03mg/L,自然光源。飼養周期為56d。

1.4 樣品采集  

待飼養試驗結束時,禁食24h,然后每桶隨機選取5尾花鱸置于冰盤內解剖,取出胃、腸道和肝臟,用4℃預冷的生理鹽水進行沖洗,用吸水紙吸干表面,-80℃冰箱保存。每桶另隨機選取3尾花鱸置于冰盤內解剖,取出1cm前腸(根據前中腸結點確定),固定在福爾馬林溶液內。  

采樣結束后,各桶剩余的魚恢復正常投喂,暫養1周適應環境。每天投喂2次,每次投喂1h后用虹吸法除殘餌和糞便,之后2h撈網收集長條狀包膜完整的糞便,50℃烘干后-20℃冰箱中保存備用。連續收集糞便30d。

1.5 消化酶活力  

從-80℃冰箱中取出胃、腸道和肝臟樣品,以1∶9的比例加入預冷生理鹽水勻漿,配制成10%的組織勻漿液,離心后取上清液作為待測酶液。采用福林-酚法測定蛋白酶活力,采用碘-淀粉比色法測定淀粉酶活力,使用脂肪酶測定試劑盒(南京建成生物工程研究所產品)測定脂肪酶活力。

1.6 腸道組織切片  

取福爾馬林固定24h的前腸樣品,按照乙醇梯度脫水、二甲苯透明組織塊、包埋、切片、脫蠟、染色、分化、切片脫水復染、封片步驟制作組織切片,用光學顯微鏡掃描前腸組織,觀察并記錄相關特性。

1.7 營養物質表觀消化率  

飼料和糞便的水分含量采用105℃烘箱干燥法(GB/T 6435—2014)測定;粗蛋白質含量采用凱氏定氮法(GB/T 6432—1994)測定;粗脂肪含量采用(GB/T 6433—2006)索氏抽提法測定;粗灰分含量采用550℃灼燒法(GB/T 6438—2008)測定;總能采用氧彈熱量計(IKA-C2000)測定。飼料和糞便中Y2O3含量委托廣州分析測試中心采用等離子體光譜儀(SPECTRO CIOSCCD)測定。  

營養物質表觀消化率的計算公式如下:

飼料干物質表觀消化率(%)=100×[1-飼料中Y2O3含量(%)/糞便中Y2O3含量(%)];

飼料某營養物質表觀消化率(%)=100×{1-[飼料中Y2O3含量(%)/糞便中Y2O3含量(%)]×[糞便中該營養物質含量(%)/飼料中該營養物質含量(%)]}。

1.8 數據統計  

試驗數據用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析(one⁃way ANOVA),結果采用平均值±標準差表示,若組間差異顯著,則使用Duncan氏法進行多重比較,以P<0.05為差異顯著標準。

2結果

2.1 消化酶活力

由表2可知,與G0組相比,各試驗組前腸、肝臟和胃的蛋白酶活力無顯著差異(P>0.05)。G1組前腸脂肪酶活力顯著低于G0組(P<0.05),其他試驗組與G0組無顯著差異(P>0.05)。肝臟和胃脂肪酶活力在各組間無顯著差異(P>0.05)。與G0組相比,各試驗組肝臟淀粉酶活力呈上升趨勢,其中G3組與G0組的差異達到顯著水平(P<0.05)。各試驗組前腸和胃淀粉酶活力與G0組相比無顯著差異(P>0.05)。

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2.2 前腸肌層厚度和絨毛高度  

由表3可知,飼料中添加3種添加劑均能顯著提高花鱸前腸肌層厚度和絨毛高度(P<0.05),以添加植酸酶時效果最顯著。

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2.3 前腸組織切片  

如圖1所示,G0組前腸肌肉層較薄,固有結締組織不緊密,腸道內絨毛脫落較多,部分上皮細胞與固有層分離;G1組前腸腸道內褶皺明顯增多,絨毛上杯狀細胞排列緊密;G2組前腸腸道結構完整,無損傷,褶皺布滿腸腔,肌肉層明顯變厚;G3組前腸肌肉層明顯變厚,腸道結構完整無損傷,褶皺排列較為緊密,絨毛上杯狀細胞排列緊密。

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圖 1  3 種添加劑對花鱸前腸組織形態的影響(蘇木精-伊紅染色)

2.4 營養物質的表觀消化率  

由表4可知,G2組的干物質表觀消化率最高,顯著高于G0和G1組(P<0.05),與G3組無顯著差異(P>0.05)。粗蛋白質、粗脂肪和總能表觀消化率各組間無顯著差異(P>0.05)。與G0組相比,G1和G3組粗灰分表觀消化率顯著升高(P<0.05),G2組粗灰分表觀消化率則顯著降低(P<0.05)。

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3討論

3.1 3種添加劑對花鱸消化酶活力的影響  

消化酶活力是評價水產動物生理消化機能的重要指標,其高低養殖品種、養殖規格、水體環境、飼料、養殖模式、飼養方法等有關。外源核苷酸可顯著提高異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)幼魚肝胰臟蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活力。飼料中添加混合核苷酸能顯著提高羅非魚(Oreochromis niloticus)腸道蛋白酶和淀粉酶活力,對腸道脂肪酶和肝胰臟蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活力的影響不顯著。在本試驗中,復合核苷酸能顯著降低花鱸前腸脂肪酶活力,對其他消化酶活力的影響不顯著。豆粕中的胰蛋白酶抑制因子是引起消化道蛋白酶活力下降的重要因素。本試驗飼料中添加了30%的豆粕,是否是造成花鱸脂肪酶活力下降的原因呢?關于核苷酸對脂代謝影響的作用機理的研究還比較缺乏,其具體機制并不明確,有待進一步研究。

  本試驗結果顯示,飼料中添加植酸酶能顯著提高花鱸肝臟淀粉酶活力,對前腸、胃淀粉酶和肝臟脂肪酶活力無顯著影響。植酸酶在水解植物蛋白質中的植酸時,促進了營養物質的充分釋放,刺激機體內源消化酶的分泌,進而提高魚體消化酶活力。有研究發現,隨著植酸酶添加量的增加,異育銀鯽的肝胰臟淀粉酶活力表現出上升的趨勢。但是關于植酸酶對魚類消化酶活力的影響有不同的報道。飼料中添加1000U/kg植酸酶顯著提高了黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)胃、腸道蛋白酶和胃淀粉酶活力。飼料中添加500、1000或1500U/kg植酸酶均能顯著提高異育銀鯽肝胰臟蛋白酶和脂肪酶、腸道脂肪酶活力,顯著降低肝胰臟淀粉酶活力。在大菱鲆(Scophthalmus maximusL.)幼魚飼料中添加1000或2000U/kg植酸酶均顯著提高了胃和腸道蛋白酶活力。在不含磷酸二氫鈣的基礎飼料中添加500、1000或1500U/kg植酸酶均顯著提高了紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes)幼魚的腸道脂肪酶和淀粉酶活力。添加1g/kg植酸酶(2500FYT/g)顯著提高了奧尼羅非魚(Oreochromis niloticus×O. aureus)肝胰臟和腸道淀粉酶活力,而對腸道脂肪酶活力無顯著影響。植酸酶顯著提高鱸魚胃腸蛋白酶活力,對胃腸淀粉酶和脂肪酶活力無顯著影響。出現不同試驗結果的原因可能與酶的種類、用量,魚的品種、大小,飼料配方以及養殖環境不同有關。魚類各種消化器官都存在淀粉酶,而淀粉酶的分布與魚的種類有關。

芽孢桿菌具有較強的產酶特性。芽孢桿菌作為水產動物的益生菌,在飼料中添加后在消化道中分泌多種消化酶,促進營養物質消化。芽孢桿菌對水產動物消化酶活力的影響不盡一致。在低魚粉條件下,適量的枯草芽孢桿菌可顯著提高珍珠龍膽石斑魚(Epinephelus lanceolatu♂×Epinephelus fuscoguttatus♀)腸道蛋白酶和淀粉酶活力。在飼料中添加200或300mg/kg地衣芽孢桿菌均顯著提高異育銀鯽食糜蛋白酶和淀粉酶及腸道蛋白酶活力;添加400mg/kg地衣芽孢桿菌也顯著提高了食糜淀粉酶和腸道蛋白酶活力;添加地衣芽孢桿菌對肝胰臟蛋白酶活力無顯著影響,但是顯著降低了肝胰臟淀粉酶活力。飼料中添加蠟樣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌顯著降低了草魚(Ctenopharyngodon idella)腸道蛋白酶活力,并顯著提高了腸道淀粉酶活力。本試驗中,飼料中添加復合芽孢桿菌對花鱸前腸、胃和肝臟蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活力的影響不顯著。這可能與本試驗選用的是枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌復合芽孢桿菌有關,不同芽孢桿菌的作用機制有所差異,再者芽孢桿菌對動物消化酶活力的影響可能受到養殖動物品種、養殖環境、飼養管理方法及芽孢桿菌添加量的影響。

3.2 3種添加劑對花鱸前腸組織結構的影響  

腸道是消化吸收最主要的器官,是動物快速生長和健康的重要保障,腸道黏膜層形態結構是腸道的基礎結構,腸道肌肉層厚度、腸道褶皺高度和厚度增加能增強動物的消化吸收能力。一般認為,當腸道出現上皮細胞脫落、絨毛脫落、肌肉層變薄等病變時,動物的消化吸收能力會顯著降低。前腸黏膜皺褶的高低與魚類食性有一定關系,前腸的組織結構能一定程度反映魚類的消化吸收能力。本試驗結果顯示,飼料中添加復合核苷酸、植酸酶和復合芽孢桿菌能顯著增加花鱸前腸肌層厚度和絨毛高度。這與前人的研究結果類似。研究發現,飼料中補充外源核苷酸能夠提高大黃魚(Pseudosciaena crocea R.)、凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)的腸道肌肉層(腸壁)厚度和腸道褶皺;飼料中添加復合酶制劑能夠降低鯔魚腸道病變的幾率,改善腸道健康;飼料中添加復合酶制劑(主要為植酸酶和碳水化合物酶)可顯著增加草魚腸道絨毛高度和縱截面面積;飼料中添加鼠李糖乳桿菌可以改善尼羅羅非魚腸道形態結構;飼料中添加芽孢桿菌能增加虎龍斑(E.fuscoguttatus♀×E.lanceolatus♂)腸絨毛高度。

3.3 3種添加劑對花鱸營養物質表觀消化率的影響  

在真鯛(Pagrus major)幼魚飼料中添加0.2%腺苷酸(AMP)能提高生長性能、攝食率、飼料轉化率和蛋白質效率,改善干物質、粗蛋白質和粗脂肪的表觀消化率,其中干物質表觀消化率顯著高于對照組。在豆粕和花生粕部分替代魚粉飼料中添加復合核苷酸能顯著提高凡納濱對蝦對飼料干物質和粗蛋白質、粗脂肪和磷的表觀消化率。飼料中添加復合核苷酸改善了凡納濱對蝦對飼料營養物質的表觀消化率,與核苷酸的促攝食、為營養物質合成提供關鍵輔酶、提高消化酶轉運基因表達量等作用有關。而本試驗結果顯示,飼料中添加復合核苷酸能顯著提高花鱸的粗灰分表觀消化率,對其他營養物質表觀消化率無顯著影響。有關水產動物對飼料中粗灰分表觀消化率產生影響的機理研究較缺乏,有待進一步研究。 

在豆粕和花生粕部分替代魚粉飼料中添加植酸酶能顯著提高凡納濱對蝦對飼料干物質、粗蛋白質、粗脂肪和磷的表觀消化率;飼料中添加植酸酶能顯著提高黃顙魚對飼料干物質、粗蛋白質、總能、粗灰分和磷的表觀消化率,對粗脂肪表觀消化率的影響不顯著。低磷低脂飼料和無魚粉低磷低脂飼料中添加復合酶制劑可以顯著提高草魚干物質、粗蛋白質和磷表觀消化率。本試驗結果顯示,低魚粉飼料中添加植酸酶顯著提高了花鱸干物質表觀消化率,對粗蛋白質、粗脂肪和總能表觀消化率的影響不顯著。通常認為,酶制劑可以通過改變微生物組成影響營養物質的消化吸收,最終改善養殖動物的生長性能。羅非魚飼料中補充復合酶制劑(植酸酶為主)能改善腸道微生物組成,進而影響其腸道形態。植酸酶可能是通過調節食糜的物理化學性狀以及腸道微生物所需營養物質的量,同時提高具有潛在益生效應物質的含量,從而影響腸道微生態的發育,進而影響營養物質的消化吸收。本試驗也發現植酸酶能夠顯著提高花鱸的干物質表觀消化率,推測是由于植酸酶可解除植酸與一些內源性酶的結合,釋放了部分消化酶,進而提高了對飼料營養物質的消化率。關于水產動物對飼料中粗灰分表觀消化率影響的研究較少,本試驗結果顯示飼料中添加植酸酶能顯著降低花鱸的粗灰分表觀消化率,其作用機制需作進一步分析。  

復合芽孢桿菌對花鱸營養物質表觀消化率的作用效果與復合核苷酸的類似,各營養物質的表觀消化率較對照組均有提高,其中粗灰分表觀消化率顯著提高。芽孢桿菌可顯著提高奧尼羅非魚、斑節對蝦(Penaeus monodon)飼料中營養物質的表觀消化率。這可能有2個方面的原因:一方面,芽孢桿菌在宿主消化道內定植、代謝過程中,可以產生一些消化酶等物質,促進機體的消化系統對營養物質包括礦物質等的消化吸收,提高相關營養物質的表觀消化率;另一方面,芽孢桿菌可促進魚體腸道的生長發育,提高腸壁厚度、腸黏膜高度等,使腸道吸收有效面積增大,進而提高對營養物質的表觀消化率。但是關于芽孢桿菌對飼料中粗灰分表觀消化率影響的作用機制,尚需作進一步的研究。

4結論

飼料中添加植酸酶能顯著提高花鱸肝臟淀粉酶活力和干物質表觀消化率,顯著降低粗灰分表觀消化率;飼料中添加復合核苷酸顯著降低花鱸腸道脂肪酶活力,顯著提高粗灰分表觀表消化率;此外,飼料中添加復合核苷酸、植酸酶或復合芽孢桿菌均能改善花鱸腸道組織結構。

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