枯草芽孢桿菌B6 的特性及其對哺乳期母豬生產(chǎn)性能的影響
文章旨在報道一株極具益生菌開發(fā)潛力的枯草芽孢桿菌B6，通過實驗確定了該菌株高產(chǎn)功能性果聚糖的最佳碳源為蔗糖，果聚糖作為B.subtilis B6的主要功能性代謝產(chǎn)物，其胞外產(chǎn)量在100g/Ｌ以上，經(jīng)實驗驗證，該菌株產(chǎn)生的果聚糖具有很強的抗氧化作用，10 mg/mＬ果聚糖的DPPH自由基清除率和ABTS自由基清除率分別為80%和71%以上，鐵還原能力達到43.26mmol/gFeSO4當量。B.subtilis B6顯示了活菌數(shù)高，菌種性能強，生產(chǎn)成本低等優(yōu)良的應用特性。哺乳期母豬的飼喂效果顯示B.subtilis B6液體菌劑可使仔豬平均窩重提高28.8%，平均斷奶窩重提高18%，顯著提高母豬及仔豬免疫力。綜上，菌株B.subtilis B6作為特效益生菌在飼料添加劑領域將具有很大的開發(fā)潛能和市場價值。
枯草芽孢桿菌是目前畜牧養(yǎng)殖業(yè)中應用較為廣泛的益生菌。枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis )屬于革蘭氏陽性、好氧型桿狀細菌，是公認安全(GenerallyRecognized As Safe，GRAS)菌株。該菌種在自然界中分布廣泛，其產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物種類多，抑菌活性強、抑菌譜廣，同時具有激活免疫、促生長等功能特性，顯示了很好的飼用益生菌的應用潛力。
微生物來源的胞外多糖具有抗腫瘤、抗糖尿病、降血脂、提高免疫力等多種生物學功能，如來源于解淀粉芽孢桿菌的胞外多糖能夠抑制胃癌細胞MC-4和SGC-7901生長活性；來源于解淀粉芽孢桿菌LPL061的多糖具有免疫調節(jié)作用，其發(fā)酵產(chǎn)率為4.46g/Ｌ；Cellulomonas sp . GJT07發(fā)酵優(yōu)化后果聚糖產(chǎn)量為15g/Ｌ。
本文以一株高產(chǎn)功能性果聚糖的枯草芽孢桿菌為研究對象，對菌株發(fā)酵產(chǎn)果聚糖的發(fā)酵條件、果聚糖的功能活性，以及該菌株的應用特性及其對孕期母豬的飼喂效果進行了系統(tǒng)研究，為開發(fā)一株具有獨特性能的新型益生菌劑奠定了良好的理論基礎。
1材料與方法
1.1
菌種及發(fā)酵培養(yǎng)基
枯草芽孢桿菌B6（Bacillus subtilis B6）菌株由本實驗室篩選保存。
發(fā)酵培養(yǎng)基成分：400g/Ｌ 蔗糖、25g/Ｌ可溶性淀粉、5g/Ｌ酵母浸粉、磷酸氫二鉀1g/Ｌ、氯化鈉10g/Ｌ、氯化鈣0.3g/Ｌ、硫酸鋅0.01g/Ｌ、硫酸亞鐵0.03g/Ｌ、硫酸錳0.1g/Ｌ和硫酸鎂1g/Ｌ。
1.2液體發(fā)酵
① 一級種子液制備：取甘油管中保存的菌液按照2‰的接種量接種于20 mＬLB 培養(yǎng)基中，37 ℃、220r/min震蕩培養(yǎng)10~12 h。
② 二級種子液制備：將一級種子液按照2%的接種量接種于200 mＬLB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min震蕩培養(yǎng)10~12 h。
③ 三級種子液制備：將二級種子液接種至5 L發(fā)酵培養(yǎng)基中37 ℃、pH值7.0培養(yǎng)至DO上升。
④ 100L種子液制備：將三級種子液接種至100L發(fā)酵培養(yǎng)基中37 ℃、pH值7.0培養(yǎng)。罐壓0.05 MPa，通氣150~300L/min，初始轉速150 r/min。設定轉速串聯(lián)溶氧（40%），最高轉速450r/min。培養(yǎng)至溶氧開始上升，pH值偏堿時，進行移種。
⑤ 1000L罐發(fā)酵：配制300L（滅菌后400 L）發(fā)酵培養(yǎng)基115 ℃滅菌。將100 L種子液移種至1000 L發(fā)酵罐中，恒溫37 ℃、pH值7.0，初始通氣800L/min（最大為1500 L/min），初始轉速150r/min（最大轉速為350 r/min）。設定轉速串聯(lián)溶氧（30%）。
⑥ 計數(shù)與檢測：在發(fā)酵過程中每隔6h取一份菌液樣品，檢測OD600數(shù)值，以10為梯度分別稀釋至一定倍數(shù)后進行平板涂布，放入37 ℃溫箱培養(yǎng)9 h后計數(shù)。一份直接涂布，另一份80 ℃水浴10 min以后再涂布。
1.3抗氧化能力測定
① ABTS 自由基清除能力測試：100μＬ樣品溶液與3000μＬ由磷酸鹽緩沖液(10mmol/Ｌ，pH 值7.4)稀釋的ABTS 自由基溶液(其在734nm 處吸光值為0.70±0.02)快速混勻后，避光反應6min，測定反應液在734nm處的吸光度。按照公式（1）計算ABTS自由基清除率。
ABTS 自由基清除率（%）=（Ablank-Asample）/Ablank×100 ------ (1)
式中： Ablank——空白樣品吸光度；
Asample——測試樣品吸光度。
解淀粉芽孢桿菌果聚糖測試濃度為25 mg/mＬ。
② DPPH自由基清除能力測試：1mＬ樣品溶液、1mＬ由無水乙醇配制0.2 mmol/Ｌ的DPPH溶液和1mＬ二次水快速混勻后，避光反應30 min，測定反應液在517nm處的吸光值。按照公式(2)計算DPPH自由基清除率。
DPPH 自由基清除率（%）=（Ablank-Asample）/Ablank×100------(2)
式中：Ablank——空白樣品吸光度；
Asample——測試樣品吸光度。
③ 鐵還原能力測試：取100μＬ樣品溶液與3mＬ鐵還原(FRAP)試劑混勻后于37 ℃水浴中反應5min，測定593nm處吸光值。同時取濃度0~1.0 mmol/Ｌ的FeSO4溶液各100μＬ代替樣品反應，以593nm處吸光值為縱坐標，F(xiàn)eSO4濃度為橫坐標，制作標準曲線。通過標準曲線計算樣品對應的FeSO4濃度，表示鐵還原能力。
1.4
孕期母豬飼喂實驗
選擇胎次接近、健康狀況良好的長白哺乳母豬48頭，平均分成兩組，每組24頭，實驗從產(chǎn)仔前30d至哺乳仔豬22日齡斷奶結束，對照組為基礎日糧，益生組每日添加1mＬB.subtilis B6液體菌劑。
2 結果與討論
2.1 枯草芽孢桿菌B6液體發(fā)酵高產(chǎn)果聚糖
前期研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌B6 發(fā)酵過程中可產(chǎn)生具有良好生物活性的功能多糖，并鑒定其主要成分為果聚糖。本文通過實驗進一步了解不同碳源對枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)功能性低碳的影響，分別以400g/Ｌ的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、果糖為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源，其他成分不變。以2%的接種量于37℃、200 r/min 條件下培養(yǎng)24h，結果如表1所示，B.subtilis B6 發(fā)酵高效生產(chǎn)果聚糖需以蔗糖為主要的培養(yǎng)基成分，應用優(yōu)化后的培養(yǎng)基成分及發(fā)酵條件，發(fā)酵培養(yǎng)24h枯草芽孢桿菌活菌數(shù)達到1×10^10~1×10^11CFU/mＬ，發(fā)酵液中功能多糖（果聚糖）含量≥100g/Ｌ。如此高的果聚糖產(chǎn)量在枯草芽孢桿菌中并不多見，也正是由于其高產(chǎn)功能多糖的代謝特性，使得B.subtilis B6顯示了良好的益生菌活性。
據(jù)報道果聚糖作為功能性多糖，通常具有抗氧化和抗腫瘤等生物學活性，本文應用DPPH 自由基清除、ABTS 自由基清除與鐵還原能力指標來評價枯草芽孢桿菌B6 所產(chǎn)果聚糖的抗氧化活性。結果如表2 所示，隨枯草芽孢桿菌B6 果聚糖濃度的提高，其抗氧化能力隨之增強，當果聚糖濃度達到10mg/mＬ，其DPPH 自由基清除率和ABTS 自由基清除率分別達到80%和70%以上，鐵還原能力也達到抗氧化劑組鐵還原能力的69.6%。可見，枯草芽孢桿菌B6 果聚糖具有較強的抗氧化能力，作為益生菌產(chǎn)生的重要代謝產(chǎn)物，對于清除動物體內(nèi)自由基、提高免疫力、改善體質、提高抗病性將具有顯著效果。
本文對B.subtilis B6的主要應用性能指標進行了詳細測定，結果見表3所示，經(jīng)過分析，枯草芽孢桿菌B6具有活菌數(shù)高，菌種性能強，生產(chǎn)成本低等諸多優(yōu)勢。同時，該菌株在生長過程中可產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶等消化酶類，可加強宿主體內(nèi)的營養(yǎng)代謝。作為益生菌應用，B.subtilis B6也顯示了良好的抗胃酸和耐高溫等抗逆性能，其保存穩(wěn)定及有效性也很優(yōu)秀，因此，B.subtilis B6顯示了非常良好的益生菌劑開發(fā)應用潛力。
應用B.subtilis B6液體菌劑飼喂哺乳期母豬，結果如表4所示，與對照組相比，飼喂B.subtilis B6液體菌劑的母豬生產(chǎn)平均健仔數(shù)相對高，弱仔及死胎率相對低，平均窩重提高了28.8%，說明該益生菌劑對母豬生產(chǎn)具有顯著的有益效果；同時，平均斷奶窩重也較對照組提高了18%，通過觀察，飼喂B.subtilis B6液體菌劑的仔豬精神相對較好，顯著緩解仔豬腹瀉，可見B.subtilis B6液體菌劑具有顯著提高母豬及仔豬免疫力的功效。
本文針對一株高產(chǎn)果聚糖的枯草芽孢桿菌B6及其應用做了系統(tǒng)研究，該菌株作為飼用益生菌劑可產(chǎn)生功能性果聚糖作為良好的抗氧化劑，可增強動物機體免疫力和抗病性。菌株在生長過程中還可產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶等消化酶類，可加強宿主體內(nèi)的營養(yǎng)代謝。應用該活體菌劑飼喂孕期母豬，可顯著提高窩重，仔豬精神相對更好，顯著緩解仔豬腹瀉，顯著提高母豬及仔豬免疫力。可見，枯草芽孢桿菌B6具有良好的益生菌開發(fā)潛力。
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