酵母壁多糖對(duì)斷奶仔豬腸道揮發(fā)性脂肪酸和微生物菌群的影響
導(dǎo)讀
近年來(lái)，隨著畜牧業(yè)和現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，養(yǎng)豬業(yè)正逐漸成為一個(gè)技術(shù)密集和資金密集的行業(yè)。既要提供優(yōu)質(zhì)豬肉，又要不危害環(huán)境衛(wèi)生和人類(lèi)健康是近年來(lái)養(yǎng)豬業(yè)要面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。由于抗生素類(lèi)飼料添加劑的亂用、濫用，抗生素殘留、細(xì)菌多重耐藥性和環(huán)境污染等問(wèn)題日漸加劇，人們迫切需要尋找到合適的抗生素替代品。酵母壁多糖作為功能性寡糖類(lèi)物質(zhì)，其主要成分為β-葡聚糖和甘露寡糖。大量研究表明，寡糖類(lèi)物質(zhì)能夠改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，并能一定程度上提高機(jī)體的免疫性能。同樣，酵母壁多糖也被證明能夠提高畜禽的生長(zhǎng)性能和免疫功能，并能改善腸道健康，且無(wú)害無(wú)殘留。但是，它是通過(guò)怎樣的途徑來(lái)改善機(jī)體腸道健康，對(duì)斷奶仔豬腸道菌群又有怎樣的影響呢？ 揮發(fā)性脂肪酸（VFA）是微生物厭氧發(fā)酵過(guò)程的重要中間產(chǎn)物，后腸段是仔豬腸道菌群的豐富部位。對(duì)于單胃動(dòng)物，VFA 產(chǎn)生的主要部位是結(jié)腸，因?yàn)榻Y(jié)腸內(nèi)細(xì)菌首先與小腸內(nèi)未消化的復(fù)雜碳水化合物接觸，發(fā)酵活性最強(qiáng)。其次，結(jié)腸段比盲腸長(zhǎng)，微生物含量相對(duì)來(lái)說(shuō)較多。本試驗(yàn)旨在研究酵母壁多糖對(duì)斷奶仔豬腸道VFA 和微生物菌群的影響，確定其在斷奶仔豬中應(yīng)用的最適添加水平，并為酵母壁多糖在仔豬飼糧中的科學(xué)應(yīng)用提供理論依據(jù)。
1材料與方法
1.1 試驗(yàn)材料
酵母壁多糖來(lái)源于拓普生物科技有限公司，其主要成分為甘露寡糖（23.45％） 和β-葡聚糖（39.24％），粗蛋白質(zhì)含量為26.30％、粗灰分含量為3.30％、水分含量為5.35％。
1.2 試驗(yàn)動(dòng)物和分組設(shè)計(jì)
選取180頭遺傳背景一致、健康狀況良好、胎次和體重接近的21 日齡斷奶仔豬，采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，按完全隨機(jī)區(qū)組分為4個(gè)組，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)9 頭仔豬。4個(gè)組試驗(yàn)豬分別飼喂對(duì)照飼糧（未添加酵母壁多糖）、0.15％ 酵母壁多糖飼糧、0.30％酵母壁多糖飼糧和0.45％酵母壁多糖飼糧。試驗(yàn)期為21ｄ。
1.3 試驗(yàn)飼糧和營(yíng)養(yǎng)水平
仔豬飼喂玉米－豆粕型飼糧，飼糧配方參照NRC（2012） 和我國(guó)《豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（ NY/T65-2004）配制，飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表１。
1.4 飼養(yǎng)管理
仔豬飼養(yǎng)于裝有高床、漏縫地板、乳頭式飲水器的保育舍。試驗(yàn)開(kāi)始前對(duì)豬舍進(jìn)行徹底清理消毒。試驗(yàn)過(guò)程中，每日飼喂仔豬4 ～5 次。所有仔豬自由采食和飲水，其他飼養(yǎng)管理措施、免疫程序按豬場(chǎng)常規(guī)管理程序進(jìn)行
1.5 樣品采集及處理
在試驗(yàn)第21天，從每個(gè)重復(fù)中選取1 頭接近平均體重且健康狀況良好的仔豬，肌內(nèi)注射4％戊巴比妥鈉溶液進(jìn)行麻醉。待麻醉完全后，采用頸靜脈放血的辦法將其處死。剖開(kāi)腹腔，迅速分離結(jié)腸，剪取帶有食糜的腸段，結(jié)扎固定取樣部位的兩端，包被腸道食糜樣后，置于液氮中迅速冷凍，用于結(jié)腸VFA含量分析。
另取盲腸中段腸管，兩端雙線結(jié)扎，錫箔紙包被后，用保鮮膜連同棉線一端裹好，另一端貼好標(biāo)簽紙，迅速置于液氮中冷凍后， 于-80 ℃ 保存待測(cè)。
1.6 測(cè)定指標(biāo)及方法
1.6.1 結(jié)腸VFA含量的測(cè)定
將樣品解凍，參考耿梅梅等方法，準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0ｇ 結(jié)腸內(nèi)容物于EP 管中。加入1mL 超純水，漩渦振蕩致內(nèi)容物混合均勻。以15000 r/min 離心15 min，轉(zhuǎn)移上清，按體積比9∶1比例添加25％偏磷酸，冰水浴中處理3ｈ。然后通過(guò)氣相色譜儀利用外標(biāo)法測(cè)定各樣品中乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸和異戊酸含量，并計(jì)算相應(yīng)總揮發(fā)性脂肪酸（TVFA）含量。
1.6.2 盲腸細(xì)菌計(jì)數(shù)
盲腸大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌和總菌數(shù)采用平板培養(yǎng)法測(cè)定。取盲腸內(nèi)容物樣品，在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)室溫解凍。稱(chēng)取盲腸內(nèi)容物0.5ｇ 于無(wú)菌青霉素瓶中，加入滅菌后的生理鹽水5ｍＬ，漩渦振蕩器上振蕩3 ～ 5 min，然后用微量移液槍準(zhǔn)確吸取稀釋液500μＬ 至盛有4.5 mL 生理鹽水的無(wú)菌青霉素瓶中，振蕩1～ 2 min，制成10-1稀釋液，繼續(xù)重復(fù)以上稀釋步驟，依次進(jìn)行10-2～ 10-6倍比稀釋。
將盲腸內(nèi)容物稀釋液分別接種在相應(yīng)的培養(yǎng)基平皿上。大腸桿菌、乳酸桿菌、沙門(mén)氏菌、雙歧桿菌和總菌分別使用伊紅美蘭、MRS、HE、BBL和普通培養(yǎng)基培養(yǎng)，每種指標(biāo)檢測(cè)5個(gè)稀釋梯度，每個(gè)梯度3 個(gè)重復(fù)，總菌、大腸桿菌和沙門(mén)氏菌于37 ℃ 恒溫有氧培養(yǎng)24ｈ。雙歧桿菌和乳酸桿菌于37 ℃ 恒溫厭氧培養(yǎng)48 ｈ。最后取出培養(yǎng)皿，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果用1.0ｇ 腸道食糜中細(xì)菌數(shù)的對(duì)數(shù)值［Ig（CFU/g）］表示。
1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析
所有數(shù)據(jù)用Excel2003 簡(jiǎn)單處理后，采用SPSS17.0軟件中單因素方差分析（one way ANOVA）模型進(jìn)行方差分析，差異顯著再進(jìn)行Duncan氏法多重比較，用SPSS 17.0中的曲線回歸分析（curvilinearre gression）進(jìn)行相關(guān)性分析，通過(guò)飼糧酵母壁多糖添加水平與各指標(biāo)之間的二次曲線擬合，確定最佳的回歸曲線方程，計(jì)算飼糧中酵母壁多糖最適添加水平。各組數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。以Ｐ＜0.05 為顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。
2結(jié)果與分析
2.1 酵母壁多糖對(duì)斷奶仔豬結(jié)腸VFA的影響
由表２ 可知，與對(duì)照組相比，在飼糧中添加0.15％、0.30％和0.45％酵母壁多糖，仔豬結(jié)腸內(nèi)容物乙酸含量分別增加了27.57％、48.71％和34.46％（P<0.05）；添加0.30％ 和0.45％ 酵母壁多糖還顯著提高了仔豬結(jié)腸丙酸、丁酸的含量（P<0.05）；此外，0.45％酵母壁多糖組結(jié)腸戊酸含量顯著高于對(duì)照組（ P<0.05）。從整體上來(lái)看， 飼糧中添加0.30％和0.45％ 酵母壁多糖可顯著提高仔豬結(jié)腸內(nèi)容物TVFA含量（ P<0.05）。與對(duì)照組相比，0.30％和0.45％ 酵母壁多糖組TVFA 分別提高了49.72％ 和44.42％ （P
通過(guò)曲線擬合回歸方程分析發(fā)現(xiàn)，回腸中乙酸（Y1 ）和TVFA（Y2 ）含量與飼糧酵母壁多糖添加水平（X） 間均呈二次曲線關(guān)系，建立回歸方程如下：
Y1 ＝ －7513.000Ｘ2 ＋4723.203Ｘ＋
1593.519（R2 ＝ 0.677，P ＝ 0.006）；
Y2 ＝ －9497.699Ｘ2 ＋7419.340Ｘ＋
2909.547（R2 ＝ 0.727，P＝ 0.003）。
由上述回歸方程可得，當(dāng)飼糧中酵母壁多糖添加水平為0.31％時(shí)，回腸中乙酸含量值最大；當(dāng)添加水平為0.39％ 時(shí)，斷奶仔豬回腸中TVFA 含量值最大。
2.2 酵母壁多糖對(duì)斷奶仔豬盲腸微生物菌群的影響
由表3 可知，各組間盲腸中雙歧桿菌、乳酸桿菌和總菌的數(shù)量差異不顯著（P>0.05）。但飼糧中添加0.15％、0.30％ 和0.45％ 的酵母壁多糖后，仔豬盲腸沙門(mén)氏菌數(shù)分別比對(duì)照組降低了6.12％、7.93％和9.09％ （P<0.05）。另外，添加酵母壁多糖顯著降低了仔豬腸道大腸桿菌數(shù)量（P<0.05）。
通過(guò)曲線擬合回歸方程分析發(fā)現(xiàn)，盲腸中沙門(mén)氏菌（Y3）與飼糧酵母壁多糖添加水平（X）間呈二次曲線關(guān)系，建立回歸方程如下：
Y3 ＝ 3.259Ｘ2－2.636X＋6.036
（R2 ＝ 0.670，P＝ 0.007）。
由該回歸方程可得出，當(dāng)飼糧中酵母壁多糖添加水平為0.40％時(shí)，盲腸中沙門(mén)氏菌數(shù)量最少。
3討 論
3.1 酵母壁多糖對(duì)斷奶仔豬結(jié)腸VFA的影響
在單胃動(dòng)物整個(gè)消化道中，大腸是微生物含量最豐富的區(qū)域 。雖然這些微生物產(chǎn)生的內(nèi)毒素對(duì)腸道有害，但是它們維持著腸道微生態(tài)平衡，抵御外來(lái)微生物的定植，并能激活腸道免疫系統(tǒng)，更重要的是這些微生物能將復(fù)雜的碳水化合物發(fā)酵成VFA。體內(nèi)、體外試驗(yàn)均證實(shí)，寡糖可被細(xì)菌降解成大量的VFA。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，添加0.30％ 和0.45％ 酵母壁多糖能顯著提高斷奶仔豬TVFA含量。潘曉東研究發(fā)現(xiàn)甘露寡糖能顯著提高小鼠盲腸內(nèi)TVFA、丙酸和戊酸的含量。杭蘇琴等通過(guò)體外法研究甘露寡糖和甜菜汁對(duì)腸道微生物發(fā)酵的影響，發(fā)現(xiàn)甘露寡糖各組回腸中丙酸和丁酸的比例顯著高于對(duì)照組，甘露寡糖組乙酸比例顯著低于對(duì)照組。反觀本試驗(yàn)結(jié)果，酵母壁多糖能顯著提高乙酸、丙酸和丁酸的含量，而大腸中微生物能通過(guò)利用乳酸和乙酸轉(zhuǎn)化生成丁酸，且乳酸完全發(fā)酵能產(chǎn)生大量丙酸。因此推測(cè)，酵母壁多糖可能能夠促進(jìn)乳酸利用菌的增殖來(lái)達(dá)到乳酸向丁酸轉(zhuǎn)化的效果。此外本試驗(yàn)還得出，添加0.45％ 酵母壁多糖能顯著提高斷奶仔豬結(jié)腸戊酸含量。通過(guò)結(jié)腸中TVFA和乙酸含量與飼糧中酵母壁多糖添加水平得出有效回歸方程預(yù)測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)飼糧中酵母壁多糖含量分別為0.39％和0.31％時(shí)，結(jié)腸中VFA含量較高。
3.2 酵母壁多糖對(duì)斷奶仔豬盲腸微生物菌群的影響
正常情況下，動(dòng)物腸道內(nèi)各菌群相互依存、相互拮抗維持腸道的動(dòng)態(tài)平衡。但外界環(huán)境應(yīng)激（如斷奶、溫度、轉(zhuǎn)欄等）容易破壞腸道動(dòng)態(tài)平衡，導(dǎo)致腸道微生物菌群之間比例失調(diào)。研究證明，仔豬斷奶后，腸道乳酸桿菌數(shù)量下降，大腸桿菌的比例上升。添加抗生素雖能一定程度上改善仔豬腹瀉，但同樣也會(huì)破壞腸道有益菌，酵母壁多糖主要含有甘露寡糖和β－葡聚糖，飼糧中的糖類(lèi)物質(zhì)對(duì)腸道內(nèi)微生物區(qū)系有一定的影響能力。早在20 多年前，甘露寡糖和果寡糖等功能性寡糖就被證實(shí)能改善人體的腸道菌群。前期動(dòng)物試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，添加0.15％、0.30％和0.45％酵母壁多糖均能夠顯著提高斷奶仔豬平均日增重和平均日采食量，并有降低仔豬料重比和腹瀉率的趨勢(shì)。本研究結(jié)果顯示，在斷奶仔豬飼糧中添加酵母壁多糖能顯著降低盲腸沙門(mén)氏菌和大腸桿菌數(shù)量。這可能是由于甘露寡糖能夠被腸道微生物利用發(fā)酵并促進(jìn)VFA增加，一方面降低腸道pH，使得對(duì)酸度敏感的大腸桿菌、沙門(mén)氏菌等有害菌群的生長(zhǎng)就受到相應(yīng)地抑制；另一方面VFA具有降低氧化還原電位的作用，影響有害菌生長(zhǎng)和代謝必須輔酶的氧化還原作用，從而抑制致病菌。薩立富關(guān)于甘露寡糖對(duì)斷奶仔豬腸道菌群影響的研究也發(fā)現(xiàn)甘露寡糖能夠極顯著降低了腸道大腸桿菌的數(shù)量。此外，研究還發(fā)現(xiàn)甘露寡糖能夠增強(qiáng)斷奶仔豬沙門(mén)氏菌和大腸桿菌的抗感染能力 。β－葡聚糖對(duì)腸道微生物也有一定的調(diào)節(jié)作用，添加β－葡聚糖提高了腸道中乳酸桿菌、雙歧桿菌等有益菌群數(shù)量。這與本試驗(yàn)的結(jié)果相一致。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，添加0.15％、0.30％和0.45％酵母壁多糖還能一定程度上增加盲腸內(nèi)雙歧桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量，但差異不顯著。綜上試驗(yàn)結(jié)果可以得出：酵母壁多糖能夠改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，促進(jìn)盲腸內(nèi)有益菌增殖，抑制有害菌增殖。且通過(guò)盲腸中沙門(mén)氏菌數(shù)與飼糧中酵母壁多糖的回歸方程分析發(fā)現(xiàn)，酵母壁多糖的添加水平為0.40％ 時(shí)效果最佳。
4結(jié) 論
① 酵母壁多糖可以調(diào)節(jié)仔豬腸道VFA結(jié)構(gòu)和含量。當(dāng)飼糧中添加0.30％ 和0.45％ 酵母壁多糖時(shí)，仔豬結(jié)腸乙酸、丙酸、丁酸以及TVFA的含量顯著升高。
② 酵母壁多糖對(duì)改善斷奶仔豬腸道菌群結(jié)構(gòu)具有促進(jìn)作用。當(dāng)飼糧中添加0.35％ 和0.45％ 酵母壁多糖時(shí)，仔豬盲腸大腸桿菌和沙門(mén)氏菌數(shù)量顯著降低。
③ 運(yùn)用回歸方程預(yù)測(cè)，酵母壁多糖在仔豬飼糧中的適宜添加量為0.31％ ～ 0.41％。
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